一(yi)、檢驗方法(fa)驗證的基(ji)本內容

　　檢驗(yan)方法驗(yan)證(zheng)的基本內(nei)容(rong)包括方案的起草及(ji)審批(pi)，檢測儀器的確認。

　　適用性驗證(包括準確度試(shi)驗、精密度測定、線(xian)性范圍試(shi)驗、專屬性試(shi)驗等)和結果(guo)評價(jia)及批準四個的方面。

　　二、檢驗方法(fa)驗證的(de)基本(ben)步驟

　　首先是(shi)制(zhi)定驗證方案，然后(hou)對(dui)大型精密儀器進行確認，最(zui)關(guan)鍵(jian)的一步(bu)是(shi)檢(jian)驗方法的適用性試驗，最(zui)后(hou)是(shi)檢(jian)驗方法評價(jia)及批準。

　　1、驗證方案的制定

　　檢驗方法的驗證方案(an)通常由(you)質(zhi)量(liang)驗證小(xiao)組提(ti)出。根據產(chan)品的工(gong)藝條(tiao)件、原輔(fu)料(liao)化學結構、中間體、分解產(chan)物查閱有(you)關資(zi)料(liao)，提(ti)出規(gui)格(ge)標準(zhun)，確定檢查項目(mu)，規(gui)定雜質(zhi)限度(du)，即為質(zhi)量(liang)標準(zhun)草(cao)案(an)。

　　根(gen)據(ju)質(zhi)量標(biao)準草案確定(ding)檢查和試驗范圍，對檢驗方法擬定(ding)具體操作步驟，最(zui)后(hou)經有關人員審(shen)批(pi)方可實施。

　　2、大型精密儀器的確認

　　分(fen)析測試中(zhong)所用的檢測儀器一般可分(fen)為三類：

　　A、普通儀(yi)(yi)(yi)器：崩(beng)解(jie)儀(yi)(yi)(yi)，折光儀(yi)(yi)(yi)、分析(xi)天(tian)平(ping)、酸度計(ji)、溶(rong)點測定儀(yi)(yi)(yi)、電導儀(yi)(yi)(yi)等;

　　B、較精(jing)密儀(yi)(yi)器：旋(xuan)光(guang)儀(yi)(yi)、永停滴定儀(yi)(yi)、費(fei)休氏水分測定儀(yi)(yi)、 自動(dong)滴定儀(yi)(yi)、藥物溶出度(du)儀(yi)(yi)、可(ke)見分光(guang)光(guang)度(du)計、電泳(yong)儀(yi)(yi)等;

　　C、大型(xing)精(jing)密儀(yi)(yi)器：紫(zi)外(wai)分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計、紅外(wai)分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計、氣(qi)相色譜(pu)儀(yi)(yi)、高效液相色譜(pu)儀(yi)(yi)、薄層掃描(miao)儀(yi)(yi)等。

　　為了保證分析測試(shi)數據準確(que)可(ke)靠，每臺(tai)檢測儀器在(zai)投入正式使用之前(qian)都應進行確(que)認(ren)。

　　檢測儀器的(de)確認是檢驗(yan)方法驗(yan)證的(de)基礎(chu)，應在其它驗(yan)證試(shi)驗(yan)開始之前首(shou)先完成。

　　檢(jian)測儀(yi)(yi)器(qi)確(que)認(ren)工作內(nei)容應(ying)根據(ju)儀(yi)(yi)器(qi)類型。技術性能而定，通常包括(kuo)：安裝確(que)認(ren)、校正(zheng)、適用性預試驗和再確(que)認(ren)。

　　3、校正

　　校(xiao)正(zheng)(zheng)是儀(yi)器(qi)確認(ren)及檢驗方法驗證中的(de)一個(ge)重要環節，應當在驗證試驗以前(qian)進行(xing)校(xiao)正(zheng)(zheng)。紫外(wai)分光(guang)光(guang)度(du)(du)計校(xiao)正(zheng)(zheng)包括波長校(xiao)正(zheng)(zheng)、吸(xi)收度(du)(du)測試、準確度(du)(du)測試、雜散光(guang)檢查。

　　氣相色(se)譜(pu)儀(yi)與高效液相色(se)譜(pu)儀(yi)均要(yao)求(qiu)做系統適(shi)用性試驗。在規(gui)定(ding)的(de)色(se)譜(pu)條(tiao)件下測(ce)定(ding)色(se)譜(pu)柱的(de)最(zui)小理論塔板數。分離(li)度和拖尾因子，并規(gui)定(ding)變(bian)異系數應不大于(yu)2%。

　　對于化學檢(jian)驗中使用的計量儀器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均(jun)應(ying)校正。

　　4、適用性預試驗

　　儀(yi)器(qi)的安裝(zhuang)確(que)認完成以后，在其功能試驗符(fu)合要求的情(qing)況(kuang)下，應(ying)用(yong)標準品或對照品對其進行適用(yong)性檢查，以確(que)認儀(yi)器(qi)是(shi)否符(fu)合使用(yong)要求。

　　例如對(dui)熔(rong)點測(ce)定(ding)儀的適(shi)用性(xing)預(yu)試驗(yan)是采用已知溶點的甲硝唑做試驗(yan)，測(ce)試結果與已知熔(rong)點比較。

　　紫(zi)外分光光度計可用(yong)已知(zhi)含量(liang)的某標準品試驗，測得結果(guo)與已知(zhi)數值對比，確定儀器是否符合使用(yong)要求。

　　在完成(cheng)上述各(ge)項試驗工作的(de)同時，應(ying)做好相應(ying)的(de)文件記錄(lu)等資料歸(gui)檔工作，每一臺儀器均應(ying)有一套完整的(de)檔案資料。

　　5、再確認

　　為(wei)了確(que)保(bao)儀器處(chu)于(yu)良好的(de)使用狀態，對于(yu)一臺新購(gou)買(mai)的(de)儀器在(zai)確(que)認工作結束以后(hou)，應根據(ju)儀器的(de)類別。確(que)認的(de)經(jing)驗制定再(zai)確(que)認的(de)計(ji)劃。

　　再確認的時間間隔和內容要根據(ju)儀器類別和使用情況決(jue)定，一(yi)般是3個(ge)月、6個(ge)月或(huo)1年。

　　儀器再確認(ren)的(de)內容通(tong)常包括線路(lu)連接、附件(jian)備品消耗(hao)檢查、清潔工(gong)作、功能試驗、工(gong)作日記等，其中(zhong)重點安裝(zhuang)確認(ren)中(zhong)的(de)功能試驗。

　　三、檢驗方法的適用性驗證

　　藥品質量標準分析(xi)方法驗證(zheng)的目的是證(zheng)明采(cai)用(yong)的方法適合(he)于相應的檢測要求。

　　在(zai)起(qi)草(cao)藥(yao)品(pin)質量標準時，分(fen)(fen)析方法需經(jing)驗證(zheng)(zheng)：在(zai)藥(yao)物生產方法變更(geng)、制(zhi)劑(ji)的(de)組分(fen)(fen)變更(geng)、原分(fen)(fen)析方法進(jin)行(xing)修訂時，則質量標準分(fen)(fen)析方法也(ye)需進(jin)行(xing)驗證(zheng)(zheng)。

　　方法(fa)驗證(zheng)過程和結果均應記載在(zai)藥品標準起草或(huo)修(xiu)訂說明中。

　　根據(ju)《中國(guo)藥(yao)典》 (2010版)附錄XIXA的(de)原則要(yao)求，檢驗方法的(de)驗證可(ke)分(fen)為(wei)三種情況處理;

　　1、無需驗證的方法。

　　如藥典(包括USP、EP、CP、JP等(deng)各國藥典)的(de)方法，一(yi)般只做(zuo)系(xi)統適用性試驗，以(yi)確認系(xi)統是(shi)否符合(he)要(yao)求(主要(yao)指儀器穩定性及柱的(de)分離度是(shi)否達標)。

　　2、對比法。

　　已(yi)在參比(bi)實驗(yan)(yan)室驗(yan)(yan)證過的分析方(fang)(fang)(fang)法，可用對比(bi)試驗(yan)(yan)的方(fang)(fang)(fang)法來(lai)確(que)認方(fang)(fang)(fang)法的可靠性，即將本實驗(yan)(yan)室與參比(bi)實驗(yan)(yan)室用同一方(fang)(fang)(fang)法對同批樣品所測數據進行比(bi)較(如至少(shao)取(qu)五個批號(hao)，每批重復測定(ding)五次)，判(pan)斷(duan)方(fang)(fang)(fang)法在本實驗(yan)(yan)室的可行性。

　　如(ru)有差異需查明(ming)原(yuan)因或(huo)設(she)計方案，對(dui)方法進行再驗證。

　　3、需進行系統驗證的方法。

　　四(si)、檢驗方(fang)法的評價及批準

　　安(an)裝確(que)認及適用性試(shi)驗結束(shu)后(hou)，應將試(shi)驗數據(ju)資料(liao)進行匯總分析。對(dui)檢驗方法作出正確(que)的評(ping)價，驗證報告的說明(ming)及結論部分應簡明(ming)扼要。

　　試(shi)驗中(zhong)的(de)(de)(de)主(zhu)要(yao)偏差應(ying)有(you)適當(dang)解(jie)釋(shi)。然(ran)后(hou)，報主(zhu)管領導審批。檢驗方法(fa)驗證的(de)(de)(de)最終產物是一個經過驗證的(de)(de)(de)方法(fa)—根據驗證的(de)(de)(de)結果制訂(ding)的(de)(de)(de)由有(you)關領導批準的(de)(de)(de)檢驗方法(fa)。

　　五、如何(he)詳細計算檢出限?

　　在(zai)如何正確(que)或準(zhun)確(que)地(di)估(gu)算檢(jian)(jian)出(chu)限(xian)的問題上,國際(ji)分(fen)析(xi)界一(yi)直存有爭議(yi)。檢(jian)(jian)出(chu)限(xian)的特殊意義在(zai)于可以(yi)對一(yi)個(ge)給(gei)定(ding)的分(fen)析(xi)方法(fa)在(zai)低(di)濃(nong)(nong)度水平(ping)的檢(jian)(jian)測能力進行(xing)準(zhun)確(que)地(di)評估(gu)，而考察(cha)一(yi)個(ge)分(fen)析(xi)方法(fa)在(zai)低(di)濃(nong)(nong)度范圍的檢(jian)(jian)測性能，可以(yi)基(ji)于不(bu)(bu)同的角(jiao)度或不(bu)(bu)同的側(ce)重(zhong)點,如可以(yi)從最小信號值與儀器噪音之比來(lai)(lai)考察(cha)，從方法(fa)測定(ding)空白(bai)的平(ping)均波(bo)動性來(lai)(lai)統計估(gu)算,也可以(yi)根據(ju)分(fen)析(xi)方法(fa)校(xiao)準(zhun)曲線的偏差特性來(lai)(lai)定(ding)量(liang)估(gu)算等等。

　　檢(jian)出(chu)限是(shi)評(ping)價一個分析(xi)方法及測試儀(yi)器性能的重要指(zhi)標,所謂“檢(jian)出(chu)”是(shi)指(zhi)定性檢(jian)出(chu)，即(ji)判定樣品(pin)中存在有(you)濃度(du)高于空(kong)白(bai)的待測物質。

　　ACS(美國化(hua)學學會)對這一定義作了更簡明的概(gai)括:檢出限是一個分析(xi)方(fang)法能(neng)夠可靠地檢測出被分析(xi)物的最(zui)低濃度。

　　1、檢測限(limit of detection, LOD)定義:

　　在樣品中能檢出的(de)(de)(de)被測(ce)(ce)(ce)組分(fen)的(de)(de)(de)最低濃度(量)稱(cheng)為(wei)(wei)檢測(ce)(ce)(ce)限(xian)，即產生信(xin)(xin)號(峰高)為(wei)(wei)基線噪音標準差k倍(bei)時的(de)(de)(de)樣品濃度，一(yi)般為(wei)(wei)信(xin)(xin)噪比(S/N)2:1或3:1時的(de)(de)(de)濃度，對其測(ce)(ce)(ce)定(ding)的(de)(de)(de)準確度和精密度沒有確定(ding)的(de)(de)(de)要求。目(mu)前，一(yi)般將檢測(ce)(ce)(ce)限(xian)定(ding)義為(wei)(wei)信(xin)(xin)噪比(S/N)3:1時的(de)(de)(de)濃度。

　　2、計算公式為：

　　D=3N/S (1)

　　式中(zhong)：N——噪音(yin); S——檢測(ce)器靈敏(min)度;D——檢測(ce)限

　　而靈(ling)敏(min)度(du)的計算公式(shi)為：

　　S=I/Q (2)

　　式中(zhong)：S——靈(ling)敏度;I——信號響應值;Q——進樣(yang)量

　　將式(1)和式(2)合(he)并，得(de)到(dao)下式：

　　D=3N×Q/I (3)

　　式(shi)中(zhong)：Q——進(jin)樣(yang)(yang)量;N——噪音;I——信(xin)號響應值。I/N即為(wei)該進(jin)樣(yang)(yang)量下的信(xin)噪比(bi)(S/N)，該信(xin)噪比(bi)可(ke)(ke)通過工作(zuo)站對圖譜(pu)進(jin)行(xing)自動分析(xi)(xi)獲(huo)得，一般(ban)的色(se)譜(pu)或質譜(pu)工作(zuo)站都(dou)可(ke)(ke)進(jin)行(xing)信(xin)噪比(bi)分析(xi)(xi)計算。這(zhe)樣(yang)(yang)檢測限的計算方(fang)法(fa)就變得非常方(fang)便了。

　　3、計算方法：

　　實際計(ji)算時(shi)，檢(jian)(jian)出限(xian)有(you)2種表(biao)示方法(fa)(fa)：一(yi)種是進樣(yang)瓶(ping)中樣(yang)品(pin)檢(jian)(jian)測限(xian)，一(yi)種是針對原(yuan)始樣(yang)品(pin)的方法(fa)(fa)檢(jian)(jian)出限(xian)。

　　A、對第一種檢(jian)(jian)(jian)測限(xian)，只要知道進樣(yang)量(liang)和信(xin)噪(zao)比(bi)即可計(ji)算。如進樣(yang)瓶中樣(yang)品濃(nong)度為(wei)1 mg/L,在(zai)此濃(nong)度下的信(xin)噪(zao)比(bi)為(wei)300(由工作(zuo)站分析獲得(de))，則其檢(jian)(jian)(jian)測限(xian)為(wei)：D =(3×1 mg L-1)/300 = 0.01 mg/L。也可用絕(jue)對進樣(yang)量(liang)表示，若進樣(yang)體積(ji)為(wei)10 ul，則其檢(jian)(jian)(jian)測限(xian)為(wei)：D = 3×(1 mgL-1×10 ul)/300 = 0.1 ng。

　　B、對第二種(zhong)表示方法，需同時考慮原始樣(yang)品的取樣(yang)量和提取樣(yang)品的定容體(ti)積(ji)。仍按前述樣(yang)品計算，若取樣(yang)量為5克(ke)，最后定容體(ti)積(ji)為5 mL，則方法檢測限為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

　　即(ji)當(dang)原始樣(yang)(yang)(yang)品中(zhong)待檢物質的濃(nong)度為(wei)0.01mg/kg時，若(ruo)取樣(yang)(yang)(yang)量為(wei)5g,樣(yang)(yang)(yang)品經前處理后定(ding)容體積為(wei)5mL時,進樣(yang)(yang)(yang)瓶中(zhong)樣(yang)(yang)(yang)品的濃(nong)度可(ke)達(da)0.01mg/L(假定(ding)回收率(lv)為(wei)100%),此時，在其它給定(ding)的分析條件(jian)下(xia)，能產生(sheng)3倍噪聲強度的信號(hao)。在實際(ji)檢測(ce)工作中(zhong)，第二種表(biao)示方法更為(wei)常見。

　　4、注意事項

　　由(you)式(shi)(3)可見，信(xin)噪(zao)比(bi)的(de)(de)大小(xiao)直接關系到(dao)檢(jian)測限的(de)(de)大小(xiao)。信(xin)噪(zao)比(bi)計算方法的(de)(de)不(bu)同(tong)(tong)，其比(bi)值(zhi)大小(xiao)有(you)很(hen)大不(bu)同(tong)(tong)，這(zhe)與計算信(xin)噪(zao)比(bi)時(shi)基線(xian)噪(zao)聲峰值(zhi)的(de)(de)定義方式(shi)有(you)關，一般有(you)三種不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)定義：

　　A、峰/峰(peak to peak)信噪比，用某一段基線噪聲的平均(jun)高度;

　　B、峰/半峰(half peak to peak)信噪比, 用某一段基線(xian)噪聲平均(jun)高度的1/2;

　　C、均方根(RMS)信(xin)噪比，用(yong)某一(yi)段基線噪聲的均方根值計算。

　　除此之外，信(xin)噪比的(de)計算(suan)結果還和所取噪聲(sheng)(sheng)的(de)位置(zhi)有很大關系(xi)，取信(xin)號哪一側基線(xian)的(de)噪聲(sheng)(sheng)，取多(duo)長一段基線(xian)上的(de)噪聲(sheng)(sheng)，計算(suan)結果都(dou)很不完全相同，有時相差甚(shen)遠。一般多(duo)取樣(yang)品峰兩側的(de)噪聲(sheng)(sheng)峰值計算(suan)。

　　5、檢出限的確定

　　A、《全球環境監(jian)測(ce)(ce)系統水監(jian)測(ce)(ce)操作指(zhi)南》中規定(ding)：給定(ding)置信水平為(wei)95%時，樣品測(ce)(ce)定(ding)值(zhi)與零濃度樣品的(de)測(ce)(ce)定(ding)值(zhi)有顯著性差異即為(wei)檢(jian)出限：

　　L = 4.6Sb

　　式(shi)中(zhong)：L——方法的最低檢出(chu)濃度(du)。

　　Sb ——測定次數(shu)為n次的(de)空白平行測定(批內)標(biao)準差(重(zhong)復測定20次以(yi)上)。

　　B、國際(ji)純粹(cui)和應用化學聯合(he)會(hui)(IUPAC)規定(ding)對各(ge)種(zhong)光學分析方法，可用下式計(ji)算(suan)：

　　L = KSb/S

　　L——方(fang)法的最(zui)低檢出濃度(du)

　　Sb——空(kong)白(bai)多次測量(liang)的標準偏(pian)差(cha)(吸光度);

　　S ——方法(fa)的(de)靈敏度(即校(xiao)準(zhun)曲線的(de)斜率)

　　為(wei)了(le)評估 ，空白測定次(ci)數必須(xu)足夠(gou)多，最好能測20次(ci)。國際純粹(cui)和應用化學(xue)聯合會(hui)極力提倡(chang)取(qu)k值為(wei)3，一般來說，取(qu) 相應的(de)置信水平大約為(wei)90%。

　　若 =0，并不意(yi)味著 ，或檢出(chu)限(xian)無限(xian)小。這時需配(pei)制一(yi)個(ge)濃度(du)略大于零濃度(du)的試樣系(xi)列(能產生一(yi)個(ge)可(ke)測信號值)代(dai)替(ti)全(quan)程序空白試驗，求出(chu)其標準偏(pian)差，用(yong)來(lai)代(dai)替(ti) 。

　　此外(wai)，有時為(wei)了(le)工作方(fang)便和(he)便于(yu)比較，也規定一個大家能接受的信號值作為(wei)檢出限(xian)(xian)，如分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度法中(zhong)，規定吸光(guang)(guang)度為(wei)0.010所對應的濃度即為(wei)檢出限(xian)(xian)L。

　　C、 美國EPA SW—846規定(ding)方法中的檢(jian)出(chu)限為(wei)：

　　L=3.143Sb

　　D、某些分光光度法(fa)是以吸光度(扣除空白)為0.010相對(dui)應的濃度值或(huo)絕對(dui)量為檢出限，這是一種實驗室間的協定方案。

　　E、氣相色(se)譜(pu)法：檢測器恰能產生與(yu)噪(zao)(zao)音相區別的響(xiang)應信(xin)號時(shi)所需進入色(se)譜(pu)的物質最小量為檢出限，一般為噪(zao)(zao)音的二倍(bei)。

　　F、離子選擇電(dian)(dian)(dian)極(ji)(ji)法：當校準(zhun)曲(qu)線的直(zhi)線部分外延的延長線與通(tong)過(guo)空白電(dian)(dian)(dian)位且平行于濃(nong)度軸的直(zhi)線相交時，其(qi)交點所(suo)(suo)對應的濃(nong)度值(zhi)即(ji)為該離子色(se)譜所(suo)(suo)對電(dian)(dian)(dian)極(ji)(ji)法的檢出限。

　　由測得的空(kong)白值(zhi)計算出(chu)的L值(zhi)不應(ying)大于(yu)(yu)分析(xi)方法規(gui)(gui)定的最低(di)檢出(chu)濃度值(zhi)，如大于(yu)(yu)方法規(gui)(gui)定值(zhi)時，必須(xu)尋找原因降低(di)空(kong)白值(zhi)，重(zhong)新測定計算至合格(ge)。

　　6、校正曲線繪制：

　　A、按分析方(fang)法步驟，通過實(shi)測濃度和(he)儀(yi)器信(xin)號值的(de)直(zhi)線(xian)關系(xi)，確定實(shi)驗室條件下的(de)測定上(shang)限(xian)。當測定上(shang)限(xian)低(di)于方(fang)法的(de)檢測上(shang)限(xian)時，只能用實(shi)測的(de)直(zhi)線(xian)范圍(wei)。

　　B、繪制校正曲線的分(fen)析(xi)步驟(zou)應與樣品分(fen)析(xi)相(xiang)同，并且不少(shao)于5個濃度值。

　　C、校(xiao)正(zheng)(zheng)曲(qu)線繪制(zhi)與(yu)每批測定樣品(pin)同(tong)(tong)時進行(xing)，對某些分析方法(fa)的(de)校(xiao)正(zheng)(zheng)曲(qu)線的(de)斜率穩定，批間誤差較小，使用原制(zhi)校(xiao)正(zheng)(zheng)曲(qu)線時，應(ying)與(yu)樣品(pin)同(tong)(tong)時測定2份中等濃度標(biao)樣和2份空(kong)白的(de)平行(xing)樣。

　　測得標準的(de)濃度(減(jian)去空(kong)白)值與原(yuan)校(xiao)正曲線(xian)相(xiang)對應(ying)的(de)濃度值的(de)相(xiang)對偏差，分(fen)光光度應(ying)小(xiao)(xiao)于5%;原(yuan)子吸收法(fa)應(ying)小(xiao)(xiao)于10%，否則重(zhong)新制(zhi)作校(xiao)正曲線(xian)。

　　六(liu)、小結(jie)

　　最后還要(yao)(yao)特別(bie)強調(diao)，檢出限和測(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)下(xia)限是兩(liang)個不同(tong)的(de)(de)概念(nian)，它們是評(ping)價一個分(fen)析(xi)(xi)方法及測(ce)(ce)(ce)試儀器性(xing)能的(de)(de)重要(yao)(yao)指標，檢出限是一個定(ding)(ding)(ding)性(xing)概念(nian)，而測(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)下(xia)限是一個定(ding)(ding)(ding)量(liang)概念(nian)，搞清楚兩(liang)者概念(nian)和相(xiang)互關(guan)系(xi)，可(ke)提高色譜(pu)分(fen)析(xi)(xi)中(zhong)(zhong)檢測(ce)(ce)(ce)結果的(de)(de)準確性(xing)和可(ke)靠性(xing)，特別(bie)在痕量(liang)分(fen)析(xi)(xi)中(zhong)(zhong)，檢出限和測(ce)(ce)(ce)定(ding)(ding)(ding)下(xia)限的(de)(de)確定(ding)(ding)(ding)對于(yu)分(fen)析(xi)(xi)方法的(de)(de)選(xuan)擇具有(you)重要(yao)(yao)意(yi)義，同(tong)樣的(de)(de)，對于(yu)實驗室(shi)質量(liang)控制也具有(you)很(hen)重要(yao)(yao)的(de)(de)意(yi)義。