2015年6月17日，“第四屆中(zhong)(zhong)國食(shi)品(pin)(pin)(pin)(pin)與農產品(pin)(pin)(pin)(pin)質(zhi)量安(an)全(quan)檢(jian)測技(ji)(ji)術(shu)國際論壇暨展覽會(hui)”在北京國家會(hui)議中(zhong)(zhong)心開(kai)幕。此次會(hui)議特別設置(zhi)了(le)“食(shi)品(pin)(pin)(pin)(pin)與農產品(pin)(pin)(pin)(pin)安(an)全(quan)微(wei)(wei)生物(wu)檢(jian)測”、“食(shi)品(pin)(pin)(pin)(pin)與農產品(pin)(pin)(pin)(pin)中(zhong)(zhong)重金屬(shu)元素和其他(ta)有害物(wu)質(zhi)檢(jian)測”、“飲用水安(an)全(quan)檢(jian)測”等九個專題。大(da)會(hui)第二(er)天，來自北京出入(ru)境檢(jian)驗檢(jian)疫局的(de)曾靜博士在“食(shi)品(pin)(pin)(pin)(pin)與農產品(pin)(pin)(pin)(pin)安(an)全(quan)微(wei)(wei)生物(wu)檢(jian)測”專題中(zhong)(zhong)做了(le)題為“微(wei)(wei)生物(wu)鑒(jian)定技(ji)(ji)術(shu)的(de)發展歷(li)程”的(de)報告(gao)。

專題現場

北京出入境檢驗檢疫局 曾靜博士

　　隨著(zhu)人(ren)們生(sheng)活水平的(de)不(bu)斷提高，食品安全問題越(yue)來越(yue)受到人(ren)們的(de)重視，微生(sheng)物對食品的(de)污染問題也相應地備受關注。微生(sheng)物包(bao)括細菌、真菌等，有些微生(sheng)物還是致病(bing)菌，對人(ren)體的(de)危害很大，因此食品中微生(sheng)物的(de)檢測(ce)非常(chang)重要。

　　在報告中曾靜(jing)介紹，微(wei)生物(wu)(wu)鑒定(ding)技術在檢(jian)(jian)驗(yan)(yan)檢(jian)(jian)疫;食品、化妝品等(deng)產品致(zhi)病(bing)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)檢(jian)(jian)測;動(dong)物(wu)(wu)源性致(zhi)病(bing)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)檢(jian)(jian)測;植物(wu)(wu)病(bing)原細菌(jun)(jun)(jun)、真菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)檢(jian)(jian)測等(deng)工(gong)(gong)作中起到非常(chang)關鍵的(de)(de)作用。檢(jian)(jian)驗(yan)(yan)檢(jian)(jian)疫工(gong)(gong)作中的(de)(de)微(wei)生物(wu)(wu)鑒定(ding)工(gong)(gong)作主(zhu)要(yao)有判斷該(gai)菌(jun)(jun)(jun)是(shi)不是(shi)目標(biao)的(de)(de)致(zhi)病(bing)菌(jun)(jun)(jun)和新發現的(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)種類兩項(xiang)內容。相比而言(yan)，后(hou)(hou)者需要(yao)做(zuo)更完(wan)善的(de)(de)實驗(yan)(yan)，參考多種方法(fa)相互印證以后(hou)(hou)才能確定(ding)該(gai)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)種類。

　　曾靜說，目(mu)前微(wei)生物鑒定(ding)技(ji)術(shu)的(de)發展有(you)兩個(ge)方(fang)向，速(su)度快和分型能(neng)(neng)力(li)強。速(su)度快的(de)微(wei)生物鑒定(ding)技(ji)術(shu)主(zhu)要以飛行時(shi)間質譜(pu)(MALDI-TOF MS)鑒定(ding)技(ji)術(shu)為典型代表，可以在數十秒內實現微(wei)生物的(de)鑒定(ding);分型能(neng)(neng)力(li)強的(de)鑒定(ding)技(ji)術(shu)主(zhu)要包括各種基于DNA的(de)鑒定(ding)技(ji)術(shu)。

　　在報告中，曾靜介紹，微生物(wu)鑒定(ding)技(ji)術主要有形態學觀察、全自動(dong)微生物(wu)生化鑒定(ding)系統(tong)和依據細胞物(wu)質(zhi)進行微生物(wu)鑒定(ding)技(ji)術等(deng)方(fang)法(fa)。她在報告中對三種方(fang)法(fa)進行了詳細的闡述。

　　據她介紹，微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)的形(xing)態學觀察主要(yao)(yao)是(shi)依據微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)的形(xing)態和(he)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)理(li)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)反應(ying)等特征來(lai)(lai)進行微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)的分(fen)類(lei)和(he)鑒定(ding)。用微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)的形(xing)態特征來(lai)(lai)鑒定(ding)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)是(shi)由于微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)的形(xing)態比較單一，容易分(fen)辨;用微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)的生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)理(li)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)反應(ying)特征來(lai)(lai)鑒定(ding)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)主要(yao)(yao)是(shi)依據微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)細胞壁的組成、微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)發(fa)酵產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)和(he)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)對(dui)碳源(yuan)、氮源(yuan)等養分(fen)的利(li)用。

　　曾靜(jing)同(tong)時提(ti)到這種(zhong)方(fang)法相對比較繁瑣、耗時，因此近年來被全自動微生物生化鑒定系(xi)統逐步替代。

　　她介紹道，全(quan)(quan)自動微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)鑒定(ding)(ding)系統實(shi)際上(shang)是將多(duo)個生(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)反應(ying)有效整(zheng)合(he)、濃縮于商(shang)業化(hua)的(de)板卡上(shang)，方(fang)便實(shi)驗(yan)室(shi)進行(xing)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)的(de)鑒定(ding)(ding)。全(quan)(quan)自動微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)鑒定(ding)(ding)系統具有以下(xia)優點：1.生(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)反應(ying)數量(liang)多(duo)，商(shang)業化(hua)的(de)卡板最多(duo)可集(ji)合(he)45-46種生(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)反應(ying);2.實(shi)驗(yan)操作(zuo)標準化(hua)，節省大量(liang)人(ren)工;3.鑒定(ding)(ding)速度(du)快，一般(ban)3-4小時即可出鑒定(ding)(ding)結果。基于以上(shang)優點，目前，全(quan)(quan)自動微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)鑒定(ding)(ding)系統已經作(zuo)為實(shi)驗(yan)室(shi)中(zhong)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)的(de)日常鑒定(ding)(ding)手段。除此之外，全(quan)(quan)自動微(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)鑒定(ding)(ding)系統還具有細菌的(de)MIC值測定(ding)(ding)和耐藥表型的(de)檢測等作(zuo)用(yong)。

　　曾靜在(zai)介紹依據(ju)細胞物質(zhi)進行微生(sheng)(sheng)物鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)(ji)術(shu)時(shi)說，該(gai)(gai)技(ji)(ji)術(shu)主要包括蛋白質(zhi)的(de)檢測(ce)(ce)和DNA的(de)檢測(ce)(ce)，是目前微生(sheng)(sheng)物鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)(ji)術(shu)的(de)兩個發展方(fang)向。依據(ju)蛋白質(zhi)檢測(ce)(ce)的(de)鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)(ji)術(shu)，具有鑒(jian)(jian)定(ding)速度快的(de)特點，主要檢測(ce)(ce)儀器有飛行時(shi)間質(zhi)譜。基于DNA檢測(ce)(ce)的(de)鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)(ji)術(shu)，對微生(sheng)(sheng)物的(de)分型能力(li)很強，該(gai)(gai)檢測(ce)(ce)技(ji)(ji)術(shu)主要有16S rDNA測(ce)(ce)序技(ji)(ji)術(shu)、PFGE和全基因組(zu)測(ce)(ce)序技(ji)(ji)術(shu)等。

　　在(zai)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)檢測(ce)方面，曾靜介紹說，利用飛行時間質(zhi)(zhi)(zhi)譜進行微生物(wu)鑒定的(de)原理是通過質(zhi)(zhi)(zhi)譜獲得微生物(wu)特征(zheng)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)分(fen)子的(de)“指紋圖(tu)譜”，然后(hou)與(yu)大(da)容量的(de)數(shu)據庫(ku)進行對比(bi)，最終實現(xian)菌(jun)落或者(zhe)菌(jun)株水平上的(de)鑒定。質(zhi)(zhi)(zhi)譜鑒定系統的(de)優勢主要體現(xian)在(zai)鑒定速度快，僅(jin)需十余秒即可完成。

　　在DNA檢(jian)測(ce)(ce)技(ji)術方面，曾靜分別就16S rDNA測(ce)(ce)序技(ji)術、PFGE和全基因組測(ce)(ce)序技(ji)術做了詳細的闡述。

　　她(ta)說道，16S rDNA基(ji)(ji)因是細菌(jun)核糖體(ti)DNA的(de)(de)(de)一部分(fen)(fen)，被稱為(wei)細菌(jun)的(de)(de)(de)“活化(hua)(hua)石”，該(gai)基(ji)(ji)因進化(hua)(hua)速度十分(fen)(fen)緩慢，具(ju)有(you)生物鐘的(de)(de)(de)特點，已經(jing)作為(wei)細菌(jun)系(xi)統發育的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因，16S rDNA序列(lie)測定是科研(yan)領域(yu)(yu)細菌(jun)分(fen)(fen)類和鑒定的(de)(de)(de)金標準。目前(qian)，常見的(de)(de)(de)商業化(hua)(hua)測序系(xi)統有(you)針對細菌(jun)16S rDNA中的(de)(de)(de)500bp保(bao)守序列(lie)進行(xing)測序、針對真(zhen)菌(jun)的(de)(de)(de)28S rDNA的(de)(de)(de)D2基(ji)(ji)因區域(yu)(yu)進行(xing)測序等。該(gai)方(fang)法獲得的(de)(de)(de)數據有(you)利于致病(bing)菌(jun)的(de)(de)(de)溯(su)源分(fen)(fen)析，但是操作過程具(ju)有(you)一定的(de)(de)(de)復雜度，耗時(shi)較長，另外，基(ji)(ji)因測序儀和測序耗材試劑的(de)(de)(de)價(jia)格較貴，因此不(bu)利于在應用層面進行(xing)推廣(guang)。

　　報(bao)告中，曾靜對(dui)(dui)(dui)PFGE闡述道，PFGE(脈(mo)沖場(chang)凝(ning)膠電(dian)泳(yong))是(shi)一(yi)種分(fen)離(li)(li)大分(fen)子DNA的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)。此種方(fang)(fang)法(fa)(fa)的(de)(de)原(yuan)理是(shi)將細菌(jun)包埋于瓊(qiong)脂(zhi)塊(kuai)中，用適當的(de)(de)內切(qie)(qie)酶(mei)在原(yuan)位對(dui)(dui)(dui)整個(ge)細胞染色體進(jin)行(xing)酶(mei)切(qie)(qie)，酶(mei)切(qie)(qie)片(pian)段(duan)在特定的(de)(de)電(dian)泳(yong)系統中通過(guo)電(dian)場(chang)方(fang)(fang)向的(de)(de)不(bu)斷交替變換和適合的(de)(de)脈(mo)沖時(shi)間等條件作(zuo)用而得(de)到(dao)良好分(fen)離(li)(li)的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)。PFGE的(de)(de)分(fen)型能(neng)力極強(qiang)，可(ke)區分(fen)菌(jun)株水平的(de)(de)差異，目前被全世界各(ge)個(ge)國家普遍使用。通過(guo)PFGE分(fen)型可(ke)以(yi)對(dui)(dui)(dui)細菌(jun)性(xing)傳染病(bing)、食源(yuan)性(xing)致病(bing)菌(jun)進(jin)行(xing)監(jian)測(ce)，同時(shi)可(ke)以(yi)進(jin)行(xing)分(fen)子流行(xing)病(bing)學的(de)(de)調查(cha)，但是(shi)操作(zuo)較為繁瑣，需(xu)要較高的(de)(de)實驗技能(neng)方(fang)(fang)可(ke)掌握。

　　在(zai)(zai)全基因(yin)組測序(xu)技術方(fang)面，曾靜(jing)介紹說(shuo)，該技術可以(yi)對菌株進(jin)行(xing)最為有效的分(fen)型(xing)，即使是16S差(cha)異不(bu)大(da)的菌株，也(ye)可以(yi)通(tong)過(guo)分(fen)布在(zai)(zai)整個基因(yin)組上的單核(he)苷酸多態性位點(dian)(SNP)進(jin)行(xing)區(qu)分(fen)，是目(mu)前(qian)分(fen)型(xing)能力(li)最為強(qiang)大(da)的技術之一。全基因(yin)組測序(xu)用(yong)于微生物鑒定(ding)工(gong)作的主要障礙在(zai)(zai)于使用(yong)成本(ben)高和(he)專業的數(shu)據分(fen)析。

　　最后，曾靜提到，對(dui)于檢(jian)驗檢(jian)疫(yi)工作來說，需要根據(ju)實際(ji)情況(kuang)選擇合(he)適的(de)微(wei)生(sheng)物鑒定方(fang)法。同時(shi)，為了更(geng)快速(su)、更(geng)準確(que)的(de)確(que)認病(bing)原微(wei)生(sheng)物，可能需要幾種鑒定方(fang)法聯合(he)使用(yong)，例如可以(yi)先利(li)用(yong)質譜鑒定速(su)度快的(de)優勢迅速(su)判斷致病(bing)菌，然后再利(li)用(yong)分子生(sheng)物學的(de)手段進行分型(xing)和流行病(bing)學的(de)調查。