檢驗方法驗證的基本內容包括方案的起草及審批，檢測儀器的確認。

適用性(xing)驗(yan)證(zheng)（包括準確(que)度(du)試驗(yan)、精密(mi)度(du)測(ce)定、線性(xing)范圍試驗(yan)、專屬性(xing)試驗(yan)等）和結果評價及批(pi)準四個的方面。

首(shou)先是(shi)制定驗(yan)(yan)證方(fang)案，然后(hou)對(dui)大型精密儀(yi)器(qi)進行(xing)確(que)認，最關鍵的(de)一步是(shi)檢驗(yan)(yan)方(fang)法(fa)的(de)適用性試驗(yan)(yan)，最后(hou)是(shi)檢驗(yan)(yan)方(fang)法(fa)評價及批準。

1、驗證方案的制定

檢(jian)驗方法的驗證方案(an)通常由質量驗證小組提(ti)出。根據產(chan)品的工藝條件、原(yuan)輔料化學結(jie)構、中間體、分(fen)解產(chan)物查閱有關資(zi)料，提(ti)出規格標準，確定檢(jian)查項目，規定雜質限(xian)度(du)，即為(wei)質量標準草(cao)案(an)。

根據質量標準草案(an)確定檢查(cha)和試驗范圍，對檢驗方法擬定具體操(cao)作步驟，最后經(jing)有(you)關人員(yuan)審(shen)批(pi)方可實施。

2、大(da)型精密(mi)儀(yi)器的(de)確(que)認

分(fen)析測(ce)(ce)試(shi)中所用的檢測(ce)(ce)儀(yi)器一般可(ke)分(fen)為三(san)類(lei)：

A、普(pu)通儀(yi)器：崩(beng)解儀(yi)，折光儀(yi)、分析天平、酸度(du)計、溶點測定儀(yi)、電導儀(yi)等;

B、較精(jing)密儀(yi)器：旋光(guang)儀(yi)、永停滴定儀(yi)、費(fei)休氏(shi)水分(fen)測(ce)定儀(yi)、 自動滴定儀(yi)、藥(yao)物(wu)溶(rong)出度(du)儀(yi)、可見(jian)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、電泳儀(yi)等(deng)；

C、大型(xing)精密儀(yi)(yi)器(qi)：紫外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、紅外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、氣相色譜儀(yi)(yi)、高效(xiao)液相色譜儀(yi)(yi)、薄(bo)層掃(sao)描儀(yi)(yi)等。

為了保證分析測(ce)試數據準確(que)可靠(kao)，每臺檢測(ce)儀器在投入(ru)正式使用(yong)之前都應進行(xing)確(que)認。

檢測儀(yi)器的確認是檢驗(yan)方法驗(yan)證的基(ji)礎，應在其(qi)它驗(yan)證試驗(yan)開始之前首(shou)先(xian)完成。

檢(jian)測儀(yi)器(qi)確認工作內容(rong)應(ying)根據儀(yi)器(qi)類型。技術性(xing)能而(er)定，通常(chang)包括：安裝確認、校正、適用性(xing)預試驗和(he)再確認。

3、校(xiao)正

校(xiao)正(zheng)是儀器確認(ren)及檢驗(yan)(yan)方法驗(yan)(yan)證(zheng)中的一個(ge)重(zhong)要環節，應當在驗(yan)(yan)證(zheng)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)以前進行校(xiao)正(zheng)。紫外分光(guang)光(guang)度(du)(du)計(ji)校(xiao)正(zheng)包括波長(chang)校(xiao)正(zheng)、吸(xi)收度(du)(du)測(ce)試(shi)(shi)、準(zhun)確度(du)(du)測(ce)試(shi)(shi)、雜散(san)光(guang)檢查。

氣相色譜(pu)儀(yi)與高效液(ye)相色譜(pu)儀(yi)均要求(qiu)做系(xi)統適用性試驗。在規定(ding)的(de)色譜(pu)條件下測定(ding)色譜(pu)柱的(de)最(zui)小理論塔(ta)板數。分離度和拖(tuo)尾(wei)因子，并規定(ding)變異系(xi)數應不大于2％。

對于化學檢驗中使(shi)用的計量儀器包(bao)括容量瓶、移(yi)液管、滴(di)定管、分(fen)析天平亦均應校正。

4、適用性預試驗

儀(yi)器(qi)的(de)安裝確認完成以后，在其(qi)功能試驗(yan)符合(he)(he)要(yao)求(qiu)(qiu)的(de)情況下(xia)，應用標(biao)準品或對(dui)照品對(dui)其(qi)進行適用性(xing)檢查，以確認儀(yi)器(qi)是否符合(he)(he)使(shi)用要(yao)求(qiu)(qiu)。

例如對熔點測定(ding)儀的適用性(xing)預試(shi)驗是采(cai)用已(yi)知(zhi)溶點的甲硝唑做試(shi)驗，測試(shi)結果與(yu)已(yi)知(zhi)熔點比(bi)較。

紫外分光(guang)光(guang)度計可用已(yi)知(zhi)含量的某標準(zhun)品試驗，測得結果(guo)與已(yi)知(zhi)數值(zhi)對比，確定儀(yi)器是否符合使(shi)用要求。

在完成(cheng)上述各(ge)項試驗工作(zuo)的同時，應做好相應的文件記(ji)錄等資料歸(gui)檔工作(zuo)，每(mei)一臺(tai)儀器均應有一套完整的檔案(an)資料。

5、再確認

為了(le)確保儀器(qi)處(chu)于良好的(de)使用狀態(tai)，對于一臺新(xin)購買的(de)儀器(qi)在(zai)確認(ren)工作結束以后(hou)，應根據儀器(qi)的(de)類別。確認(ren)的(de)經驗制定再確認(ren)的(de)計(ji)劃。

再(zai)確認的(de)時間(jian)(jian)間(jian)(jian)隔(ge)和內(nei)容要根(gen)據儀器類(lei)別(bie)和使用情況(kuang)決(jue)定，一般是3個月、6個月或1年。

儀(yi)器再(zai)確認的(de)內容通常包括線路連接、附件備品消耗檢查、清潔工作、功能(neng)試驗、工作日記等，其中重點安裝確認中的(de)功能(neng)試驗。

藥品質量標準分析方法驗證(zheng)的(de)目的(de)是證(zheng)明(ming)采用的(de)方法適合于相應的(de)檢測要求(qiu)。

在起草藥品質量標準時，分(fen)析方(fang)法(fa)需經(jing)驗(yan)證：在藥物生產方(fang)法(fa)變更(geng)、制劑的組分(fen)變更(geng)、原(yuan)分(fen)析方(fang)法(fa)進行(xing)修訂時，則質量標準分(fen)析方(fang)法(fa)也需進行(xing)驗(yan)證。

方法驗證過程和結果(guo)均應(ying)記(ji)載(zai)在藥(yao)品標準(zhun)起草(cao)或修訂說明中。

根據《中國(guo)藥典》 附錄XIXA的原則要求(qiu)，檢驗(yan)方法的驗(yan)證可分為三種情況處理；

1、無(wu)需(xu)驗證的方(fang)法。如(ru)藥典(dian)(包(bao)括USP、EP、CP、JP等各國藥典(dian))的方(fang)法，一般只做系統(tong)適(shi)用性試驗，以(yi)確認系統(tong)是否(fou)符(fu)合要求(qiu)(主要指(zhi)儀器穩定性及柱(zhu)的分(fen)離度是否(fou)達標)。

2、對比(bi)法。已(yi)在參(can)比(bi)實(shi)驗室驗證過的(de)分(fen)析方(fang)法，可用對比(bi)試驗的(de)方(fang)法來確(que)認方(fang)法的(de)可靠性(xing)，即(ji)將本(ben)實(shi)驗室與參(can)比(bi)實(shi)驗室用同一(yi)方(fang)法對同批(pi)樣(yang)品(pin)所測(ce)數據進行比(bi)較(如(ru)至少取(qu)五(wu)個批(pi)號，每批(pi)重(zhong)復測(ce)定五(wu)次)，判斷方(fang)法在本(ben)實(shi)驗室的(de)可行性(xing)。

如有差異需查(cha)明(ming)原(yuan)因或設(she)計方案(an)，對方法進行再驗證。

3、需進行系(xi)統驗證(zheng)的方法。

安裝確認及(ji)(ji)適(shi)用性試驗結束(shu)后，應(ying)將試驗數據資料進行匯總(zong)分析。對檢驗方法(fa)作出正(zheng)確的(de)評價，驗證報告(gao)的(de)說明及(ji)(ji)結論部(bu)分應(ying)簡明扼要。

試驗中的主(zhu)要偏差應有適當(dang)解釋(shi)。然(ran)后，報主(zhu)管領導(dao)審批。檢(jian)驗方法驗證(zheng)(zheng)的最終產物是一(yi)個經過驗證(zheng)(zheng)的方法—根據驗證(zheng)(zheng)的結果制(zhi)訂的由(you)有關領導(dao)批準的檢(jian)驗方法。

在(zai)如(ru)何正確或準(zhun)確地估算(suan)檢(jian)出限的(de)(de)(de)問(wen)題(ti)上(shang),國際分析界一直存有爭議(yi)。檢(jian)出限的(de)(de)(de)特殊意義在(zai)于可(ke)以(yi)對一個給(gei)定的(de)(de)(de)分析方(fang)(fang)法(fa)在(zai)低濃度(du)水(shui)平(ping)的(de)(de)(de)檢(jian)測能(neng)力進行準(zhun)確地評估，而考察(cha)一個分析方(fang)(fang)法(fa)在(zai)低濃度(du)范圍的(de)(de)(de)檢(jian)測性(xing)(xing)能(neng)，可(ke)以(yi)基于不同的(de)(de)(de)角度(du)或不同的(de)(de)(de)側重點(dian),如(ru)可(ke)以(yi)從最(zui)小信號值與儀器噪音之比來考察(cha)，從方(fang)(fang)法(fa)測定空白的(de)(de)(de)平(ping)均波動(dong)性(xing)(xing)來統(tong)計估算(suan),也(ye)可(ke)以(yi)根據分析方(fang)(fang)法(fa)校準(zhun)曲線的(de)(de)(de)偏(pian)差特性(xing)(xing)來定量(liang)估算(suan)等等。

檢出限是評價一個分析方(fang)法及(ji)測(ce)試儀器性能(neng)的(de)重要指標,所(suo)謂“檢出”是指定性檢出，即判定樣(yang)品(pin)中存在有濃(nong)度高于空白的(de)待測(ce)物質。

ACS(美國化學(xue)學(xue)會(hui))對這一(yi)定義作了更(geng)簡明(ming)的概(gai)括:檢(jian)出限(xian)是一(yi)個分(fen)析方(fang)法能夠(gou)可靠地檢(jian)測出被分(fen)析物的最低濃度(du)。

1、檢測(ce)限（limit of detection, LOD）定義:

在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度（量）稱為檢測限，即產生信號（峰高）為基線噪音標準差k倍時的樣品濃度，一般為信噪比（S/N）2:1或3:1時的濃度，對其測定的準確度和精密度沒有確定的要求。目前，一般將檢測限定義為信噪比（S/N）3:1時的濃度。

2、計算(suan)公(gong)式為：

D=3N/S （1）

式中(zhong)：N——噪音; S——檢(jian)(jian)測器(qi)靈敏度(du)；D——檢(jian)(jian)測限

而靈敏度的計算公式為：

S=I/Q （2）

式中：S——靈敏度；I——信(xin)號響應值(zhi)；Q——進(jin)樣(yang)量

將式(shi)（1）和式(shi)（2）合并，得到下式(shi)：

D=3N×Q/I (3)

式中：Q——進(jin)樣(yang)(yang)量；N——噪(zao)音；I——信號響應(ying)值。I/N即為(wei)該(gai)進(jin)樣(yang)(yang)量下的(de)信噪(zao)比(bi)（S/N），該(gai)信噪(zao)比(bi)可(ke)通過工作站(zhan)對圖譜(pu)(pu)進(jin)行自(zi)動分析獲得，一般的(de)色譜(pu)(pu)或質譜(pu)(pu)工作站(zhan)都可(ke)進(jin)行信噪(zao)比(bi)分析計(ji)算(suan)(suan)。這樣(yang)(yang)檢測限的(de)計(ji)算(suan)(suan)方法(fa)就(jiu)變得非常方便了。

3、計算(suan)方(fang)法：

實際計算時，檢出限有2種表示方法：一種是進樣瓶中樣品檢測限，一種是針對原始樣品的方法檢出限。

A、對(dui)第一種檢測(ce)限(xian)(xian)(xian)，只要知(zhi)道進(jin)樣量和(he)信噪(zao)比即可(ke)計算。如進(jin)樣瓶中樣品濃度為1 mg/L,在此濃度下的(de)信噪(zao)比為300(由工作(zuo)站分析獲得)，則(ze)其檢測(ce)限(xian)(xian)(xian)為：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也可(ke)用絕對(dui)進(jin)樣量表示，若進(jin)樣體積(ji)為10 ul，則(ze)其檢測(ce)限(xian)(xian)(xian)為：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。

B、對第(di)二種表示方法，需同時考慮(lv)原始樣品(pin)(pin)的(de)取樣量和提取樣品(pin)(pin)的(de)定(ding)容(rong)體積。仍按前(qian)述樣品(pin)(pin)計(ji)算，若取樣量為(wei)5克(ke)，最后定(ding)容(rong)體積為(wei)5 mL，則(ze)方法檢測限為(wei)：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

即當原始(shi)樣(yang)品中待檢物質的(de)(de)濃度(du)為(wei)0.01mg/kg時，若(ruo)取樣(yang)量為(wei)5g,樣(yang)品經前處理后定(ding)容體(ti)積為(wei)5mL時,進(jin)樣(yang)瓶中樣(yang)品的(de)(de)濃度(du)可達(da)0.01mg/L（假定(ding)回收率為(wei)100%）,此時，在(zai)其它給定(ding)的(de)(de)分析條(tiao)件下(xia)，能產生3倍(bei)噪聲強(qiang)度(du)的(de)(de)信號。在(zai)實際檢測工作(zuo)中，第二種表示方法(fa)更為(wei)常(chang)見。

4、注意事項(xiang)

由式（3）可見，信噪比的大小直接關系到檢測限的大小。信噪比計算方法的不同，其比值大小有很大不同，這與計算信噪比時基線噪聲峰值的定義方式有關，一般有三種不同的定義：

A、峰(feng)/峰(feng)（peak to peak）信噪(zao)比(bi)，用某一段基線噪(zao)聲(sheng)的平(ping)均(jun)高度；

B、峰/半峰（half peak to peak）信噪(zao)比(bi), 用某一段基(ji)線噪(zao)聲平均高(gao)度(du)的1/2；

C、均方(fang)根（RMS）信噪(zao)比，用某一段基(ji)線(xian)噪(zao)聲的均方(fang)根值計算。

除此之外，信噪(zao)(zao)比的計算結(jie)果(guo)還(huan)和所取(qu)噪(zao)(zao)聲的位(wei)置(zhi)有(you)很大關系，取(qu)信號哪一側基線的噪(zao)(zao)聲，取(qu)多長一段基線上的噪(zao)(zao)聲，計算結(jie)果(guo)都很不完全(quan)相(xiang)同，有(you)時相(xiang)差甚(shen)遠。一般(ban)多取(qu)樣品峰(feng)兩側的噪(zao)(zao)聲峰(feng)值(zhi)計算。

5、檢出限的確(que)定

A、《全(quan)球環境(jing)監(jian)(jian)測(ce)系統(tong)水(shui)監(jian)(jian)測(ce)操作指南》中規定(ding)(ding)：給定(ding)(ding)置信水(shui)平為(wei)95%時，樣(yang)品測(ce)定(ding)(ding)值與零濃度樣(yang)品的測(ce)定(ding)(ding)值有顯著性(xing)差異即(ji)為(wei)檢出限：

L = 4.6Sb

式中：L——方法的最(zui)低(di)檢出濃(nong)度。

Sb ——測定(ding)次(ci)(ci)(ci)數為n次(ci)(ci)(ci)的空白(bai)平(ping)行(xing)測定(ding)（批內）標(biao)準差(cha)（重復測定(ding)20次(ci)(ci)(ci)以上）。

B、國際純(chun)粹和應(ying)用化(hua)學聯(lian)合會（IUPAC）規定(ding)對(dui)各種(zhong)光學分析方(fang)法，可用下式計算：

L = KSb/S

L——方法(fa)的最低檢出濃度

Sb——空白多次測量的標準偏差（吸光度）；

S ——方法的(de)靈(ling)敏度（即校準曲線(xian)的(de)斜率）

為(wei)了評估 ，空(kong)白測定次數必須足(zu)夠多，最好能測20次。國際(ji)純粹(cui)和(he)應用(yong)化學聯合會極力提倡取(qu)k值為(wei)3，一般(ban)來說，取(qu) 相應的置(zhi)信水平大約(yue)為(wei)90%。

若 =0，并不(bu)意味(wei)著 ，或檢出(chu)限無限小。這時需(xu)配制(zhi)一(yi)個濃(nong)度略大(da)于零濃(nong)度的試樣系列（能(neng)產生一(yi)個可測信號(hao)值）代(dai)替(ti)全程序空白試驗，求出(chu)其標準(zhun)偏(pian)差，用來代(dai)替(ti) 。

此外，有(you)時(shi)為(wei)(wei)(wei)了(le)工(gong)作(zuo)方便(bian)和便(bian)于比較，也規定(ding)一個大家能接受的信號值作(zuo)為(wei)(wei)(wei)檢(jian)出限(xian)，如分(fen)光(guang)光(guang)度法中(zhong)，規定(ding)吸光(guang)度為(wei)(wei)(wei)0.010所對應的濃(nong)度即(ji)為(wei)(wei)(wei)檢(jian)出限(xian)L。

C、 美(mei)國EPA SW—846規(gui)定方法中的檢出限為：

L=3.143Sb

D、某些分光光度法(fa)是以吸光度（扣除空白）為(wei)0.010相(xiang)對應的濃度值或絕對量(liang)為(wei)檢出限，這是一種實驗室間的協(xie)定方案。

E、氣相色(se)譜(pu)法：檢測器恰能(neng)產生與噪音(yin)(yin)相區別的響應(ying)信號(hao)時(shi)所需進入色(se)譜(pu)的物質(zhi)最小量為檢出限，一般為噪音(yin)(yin)的二倍(bei)。

F、離(li)子(zi)選擇電(dian)極法：當(dang)校準曲線的(de)(de)(de)(de)直線部(bu)分外延的(de)(de)(de)(de)延長線與(yu)通過空(kong)白電(dian)位(wei)且平(ping)行于濃度(du)軸的(de)(de)(de)(de)直線相交時(shi)，其交點所對應的(de)(de)(de)(de)濃度(du)值即為該(gai)離(li)子(zi)色(se)譜所對電(dian)極法的(de)(de)(de)(de)檢出限。

由測得的(de)空白值計(ji)(ji)算(suan)出的(de)L值不應大于分(fen)析(xi)方法規(gui)定(ding)(ding)的(de)最低(di)(di)檢出濃度值，如大于方法規(gui)定(ding)(ding)值時，必須尋找原因(yin)降低(di)(di)空白值，重新(xin)測定(ding)(ding)計(ji)(ji)算(suan)至合(he)格。

6、校(xiao)正曲(qu)線(xian)繪制：

A、按分析方法步驟，通過實測濃度和儀器信號值的直線關系，確定實驗室條件下的測定上限。當測定上限低于方法的檢測上限時，只能用實測的直線范圍。

B、繪制校(xiao)正曲線(xian)的(de)分析步驟應與(yu)樣品分析相同(tong)，并且不少(shao)于5個濃度值。

C、校正曲(qu)線繪(hui)制與每批測定(ding)樣(yang)品同(tong)時(shi)進行，對(dui)某些分析(xi)方(fang)法的(de)(de)校正曲(qu)線的(de)(de)斜率穩定(ding)，批間誤差較小，使用原制校正曲(qu)線時(shi)，應(ying)與樣(yang)品同(tong)時(shi)測定(ding)2份中(zhong)等濃度標樣(yang)和2份空白的(de)(de)平行樣(yang)。

測得標準的濃度（減(jian)去空白）值與原校正曲線相對應的濃度值的相對偏差(cha)，分光光度應小(xiao)于(yu)5%；原子吸收(shou)法應小(xiao)于(yu)10%，否則(ze)重新制作校正曲線。

最后還要特別強調，檢出限和測定下限是兩個不同的概念，它們是評價一個分析方法及測試儀器性能的重要指標，檢出限是一個定性概念，而測定下限是一個定量概念，搞清楚兩者概念和相互關系，可提高色譜分析中檢測結果的準確性和可靠性，特別在痕量分析中，檢出限和測定下限的確定對于分析方法的選擇具有重要意義，同樣的，對于實驗室質量控制也具有很重要的意義。