PCR實驗室的污染來源

　　1、樣本間交(jiao)叉(cha)污染：

　　收集(ji)樣本(ben)(ben)的容器(qi)(qi)被污染(ran)或樣本(ben)(ben)密封不嚴外溢;不同(tong)樣本(ben)(ben)移液(ye)(ye)時(shi)(shi)忘記更換槍尖或未使用帶(dai)濾芯槍尖;移液(ye)(ye)器(qi)(qi)等實驗器(qi)(qi)具及耗材未及時(shi)(shi)消毒滅菌(jun);不同(tong)樣本(ben)(ben)同(tong)時(shi)(shi)開蓋(gai)或樣本(ben)(ben)劇(ju)烈震蕩(dang)、反復吹吸導致氣(qi)溶膠形成(cheng)擴(kuo)散，相互交叉污染(ran)。

　　2、實(shi)驗試劑(ji)污染：

　　主要是在 PCR 組分試(shi)劑加(jia)樣過程(cheng)中，由(you)于移(yi)液器(qi)、容器(qi)、陰性(xing)(xing)對照及其它(ta)試(shi)劑被核酸模板(ban)或陽性(xing)(xing)對照污(wu)染(ran)。 加(jia)樣過程(cheng)中，因為 PCR 試(shi)劑對溫(wen)度十(shi)分敏感，需(xu)要通過冰浴使得 PCR 試(shi)劑和 PCR 板(ban)/管處于 0℃，但這個過程(cheng)也是充滿了污(wu)染(ran)的風險的。

　　3、擴增產(chan)物(wu)污染：

　　大量(liang)拷(kao)貝(bei)的產物泄(xie)漏(lou)或擴增后的PCR反應(ying)管意外開(kai)蓋，這是 PCR 反應(ying)中最主要最常見的污染問題(ti)。因為 PCR 產物拷(kao)貝(bei)量(liang)大，遠遠高(gao)于 PCR 檢(jian)測數個拷(kao)貝(bei)的極(ji)限，所以極(ji)微量(liang)的 PCR 產物污染，就(jiu)可(ke)形成假陽性。

　　4、克(ke)隆質粒(li)污染：

　　作為陽性質控品的克隆質粒外溢。

　　PCR實驗室的防污染方法

　　按照實驗(yan)室(shi)的安(an)全(quan)(quan)工(gong)作制(zhi)度或安(an)全(quan)(quan)標準操作程序(xu)，所有操作符合(he)《實驗(yan)室(shi)生(sheng)物安(an)全(quan)(quan)通用要求》(GB19489-2008)。

　　1、嚴(yan)格(ge)執行各(ge)區功能(neng)劃分：

　　試(shi)劑儲(chu)存和準備區：貯(zhu)(zhu)存試(shi)劑的(de)制備、試(shi)劑的(de)分裝和擴增反應混(hun)合液的(de)準備，以及(ji)離心(xin)管、吸頭等消耗品的(de)貯(zhu)(zhu)存和準備。

　　標(biao)本制備區(qu)：核酸(RNA、DNA)提取、貯(zhu)存及(ji)其加入(ru)至擴增反應管(guan)。對于涉及(ji)臨(lin)床(chuang)樣(yang)本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護(hu)設(she)備、個人防護(hu)和操作規范(fan)的要求。

　　擴增(zeng)區：cDNA合成(cheng)、DNA擴增(zeng)及檢測(ce)。

　　擴增產物分析區(qu)：擴增片段的進一步分析測(ce)定，如雜交、酶切電泳(yong)、變性(xing)高效液相分析、測(ce)序等。

　　試劑(ji)準(zhun)備(bei)區(qu)、樣本制備(bei)區(qu)和擴增(zeng)區(qu)內(nei)的(de)實驗用(yong)品，包括移液器等器具應(ying)專用(yong)，空氣(qi)、物品流向依次為：試劑(ji)準(zhun)備(bei)區(qu)、樣本制備(bei)區(qu)、擴增(zeng)區(qu)、產物分析區(qu)，不(bu)可逆行。

　　2、清(qing)潔的實驗用品：

　　實(shi)驗室自配試劑(去離子(zi)水(shui)、緩沖液(ye)等)和(he)所有使(shi)(shi)用(yong)器具在使(shi)(shi)用(yong)之前均應(ying)高壓滅菌或(huo)紫外(wai)殺菌。槍尖、反應(ying)管等實(shi)驗耗材應(ying)一次性使(shi)(shi)用(yong)。

　　3、正確的實驗操作：

　　實(shi)驗應在(zai)超凈工作(zuo)臺(tai)內進(jin)行，工作(zuo)臺(tai)內應放置PCR專用的微量離心機、各量程的移液器和其(qi)他必需物品。

　　實(shi)驗(yan)的(de)過程中(zhong)選擇最合適尺寸的(de)手(shou)套并能及(ji)時(shi)更換(huan)，在進出不同實(shi)驗(yan)區域或進行模板操(cao)作后(hou)都(dou)應更換(huan)實(shi)驗(yan)服、口罩、帽子(zi)及(ji)手(shou)套，以避(bi)免不同實(shi)驗(yan)區交叉(cha)污染(ran)。

　　裝有PCR試劑的反應管(guan)在打開之前應先(xian)瞬時離心，將管(guan)壁及管(guan)蓋上的液(ye)體離至管(guan)底(di)，降低污染手套或(huo)加樣器(qi)的風(feng)險;謹慎(shen)開啟反應管(guan)，防止管(guan)內液(ye)體濺出或(huo)形成氣溶膠導致污染。

　　吸(xi)加試劑和模板(ban)的操作應嚴(yan)格按(an)照(zhao)規范要求(qiu)進(jin)行，遵守“慢吸(xi)快打”原則，盡(jin)量一次性(xing)完成，忌多次抽吸(xi)，以避免氣(qi)溶膠(jiao)產生的交叉污染。

　　PCR試(shi)劑建(jian)議小量分裝，以減少(shao)反(fan)復凍(dong)融、重復取(qu)樣次數;多樣本(ben)PCR反(fan)應時，先(xian)配制反(fan)應混合液分裝至(zhi)反(fan)應管(guan)中，最后加入樣本(ben)核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單(dan)人單(dan)管(guan)，實現完(wan)全閉管(guan)操作。

　　實(shi)驗試(shi)劑應(ying)與樣品和PCR產物(wu)分開(kai)保存，不(bu)應(ying)放(fang)于同處。

　　PCR擴增實驗完成后及(ji)時將反(fan)應(ying)管(guan)(guan)取出，用一次性(xing)手套將產物(wu)反(fan)應(ying)管(guan)(guan)包裹丟(diu)棄，保證管(guan)(guan)蓋緊閉。

　　4、規范的實驗設計：

　　應遵(zun)循實(shi)驗(yan)室內部質量控制的(de)相關規定，實(shi)驗(yan)中設立陽性(xing)對照、陰性(xing)對照和空白對照，全程(cheng)質控實(shi)驗(yan)過程(cheng)，驗(yan)證PCR反應的(de)可靠性(xing)，并協(xie)助(zhu)判斷擴增系(xi)統的(de)可信性(xing)。

　　PCR實驗室的污染應急處理方法

　　1、若核酸樣本溢出：

　　立(li)即用(yong)(yong)布或紙巾覆蓋(gai)，由外圍向(xiang)中(zhong)心傾倒10%的次(ci)氯酸(suan)消毒劑，約30分鐘后，清除污染(ran)物品，再用(yong)(yong)次(ci)氯酸(suan)消毒劑擦拭，并用(yong)(yong)75%酒精噴(pen)灑，移動紫外車定點照射1小時。

　　2、其他不明情況污染：

　　(1)暫停所有實驗操(cao)作;

　　(2)清理(li)實驗(yan)室(shi)內所有物品，尋(xun)找污染(ran)來(lai)源;

　　(3)加大(da)實驗室的通風;

　　(4)對實驗(yan)室內所有表面(mian)(臺面(mian)、地面(mian)及(ji)墻面(mian)) 進(jin)行消毒;

　　(5)75%酒(jiu)精(jing)空中噴霧;

　　(6)開啟(qi)紫(zi)外消毒(du)裝置，延長紫(zi)外照射時間(4小時以上);

　　(7)以(yi)上(shang)措施每日進(jin)(jin)行(xing)，直至污染消除;用新(xin)試劑(ji)及確認無污染的器材進(jin)(jin)行(xing)原污染項目的試劑(ji)空白(bai)檢(jian)測(ce)，連續3次均陰(yin)性后方可進(jin)(jin)行(xing)常(chang)規檢(jian)測(ce)。