質譜技術在醫學實驗室檢驗中的多種作用
2018-08-10
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由于(yu)質譜(pu)技術的(de)(de)高特(te)異(yi)性、高靈(ling)敏度、單(dan)次分(fen)析的(de)(de)快速性與檢測信息的(de)(de)豐富(fu)性，以及對(dui)復雜生物基(ji)質分(fen)析的(de)(de)高耐受(shou)性等特(te)點，臨(lin)床研究和診斷工作(zuo)也逐漸倚(yi)重于(yu)此類重要的(de)(de)新(xin)型檢測技術。如：質譜(pu)技術所能提供的(de)(de)豐富(fu)的(de)(de)檢測信息，有助于(yu)臨(lin)床更加完整地了解疾病(bing)(bing)和病(bing)(bing)理狀態，從而(er)為患者提供更為全(quan)面和準確的(de)(de)診療服務。
在美國(guo)等(deng)發達(da)國(guo)家，質譜技術(shu)已廣(guang)泛應(ying)用(yong)于(yu)醫學(xue)檢(jian)(jian)(jian)驗，基于(yu)該技術(shu)開(kai)發出的(de)(de)臨床檢(jian)(jian)(jian)測(ce)項(xiang)目(mu)(mu)已有數百項(xiang)，但我國(guo)目(mu)(mu)前仍處于(yu)起步階段，檢(jian)(jian)(jian)測(ce)項(xiang)目(mu)(mu)有70余項(xiang);應(ying)用(yong)覆蓋面非常廣(guang)泛，涵蓋了罕見(jian)和(he)(he)高難(nan)度分析，包括(kuo)微(wei)生(sheng)物(wu)鑒定、生(sheng)化檢(jian)(jian)(jian)驗(激素檢(jian)(jian)(jian)測(ce)、藥(yao)物(wu)濃度監測(ce)、遺傳性(xing)疾病檢(jian)(jian)(jian)測(ce)、營養素檢(jian)(jian)(jian)測(ce)等(deng)) 和(he)(he)分子生(sheng)物(wu)診斷 (蛋白組學(xue)、核苷酸(suan)多態性(xing)、代謝組學(xue)) [1-5];應(ying)用(yong)范圍(wei)也在逐(zhu)步擴展，從(cong)生(sheng)化檢(jian)(jian)(jian)驗、微(wei)生(sheng)物(wu)鑒定，到代謝組學(xue)、脂(zhi)質組學(xue)、蛋白組學(xue)，再到參考測(ce)量程序的(de)(de)建立(li)和(he)(he)校準品賦值(zhi)，乃(nai)至(zhi)術(shu)中(zhong)應(ying)用(yong)及床旁(pang)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)。
本文將全面闡述質譜技術在醫學實驗(yan)室認可(ke)中的發展歷程，以及在醫學檢驗領域的主要應用情況和特點，同時剖析了質譜技術目前在臨床應用中主要痛點和未來可能的發展方向，希望能較為全面地綜述質譜技術臨床應用的現狀與未來。
一(yi)、質(zhi)譜技術(shu)在醫學實驗室中的發(fa)展(zhan)
從(cong)質(zhi)(zhi)譜技術最(zui)(zui)初進入醫(yi)學檢驗(yan)領域，至今發展(zhan)至多(duo)(duo)領域、寬范(fan)圍的應(ying)用(yong)，大(da)約經歷了(le)四十年的時(shi)(shi)間，最(zui)(zui)早始于(yu)20世紀(ji)80年代。由于(yu)免(mian)疫法檢測存在(zai)(zai)假陽(yang)性，質(zhi)(zhi)譜技術開始從(cong)研(yan)究性實驗(yan)室(shi)(shi)走入臨床實驗(yan)室(shi)(shi)，如氣(qi)相色譜質(zhi)(zhi)譜 (gas chromatography mass spectrometry, GC-MS) 技術起初應(ying)用(yong)于(yu)軍(jun)事藥物(wu)(wu)監測。推動這種(zhong)轉變出(chu)現(xian)的是(shi)發生在(zai)(zai)1981年的美(mei)國尼(ni)米(mi)茲(zi)號(hao)(hao)航空母(mu)艦事故(gu)。尼(ni)米(mi)茲(zi)號(hao)(hao)是(shi)美(mei)國海(hai)軍(jun)中(zhong)最(zui)(zui)大(da)的一艘核動力航空母(mu)艦，1981年5月25日深(shen)夜，尼(ni)米(mi)茲(zi)號(hao)(hao)在(zai)(zai)準備回收模擬作戰(zhan)歸來的機群(qun)時(shi)(shi)發生意外，引發大(da)火，該事故(gu)最(zui)(zui)終(zhong)造成多(duo)(duo)人死傷(shang)。隨后采用(yong)免(mian)疫法檢測飛行(xing)員尿液樣(yang)本時(shi)(shi)發現(xian)，大(da)部分(fen)尿檢結果中(zhong)大(da)麻代謝物(wu)(wu)呈(cheng)陽(yang)性，表明(ming)軍(jun)隊中(zhong)可能存在(zai)(zai)藥物(wu)(wu)濫用(yong)情況。
因免疫法(fa)檢(jian)測(ce)結果本身存在(zai)較高的假陽(yang)性(xing)率(lv)，所以(yi)需要(yao)(yao)使(shi)(shi)用更為特(te)異的GC-MS方法(fa)進(jin)行(xing)確認。而GC-MS在(zai)應用后的10年里使(shi)(shi)大麻檢(jian)測(ce)陽(yang)性(xing)率(lv)從18%降(jiang)低至8%，這也促(cu)使(shi)(shi)了質譜(pu)技(ji)術進(jin)入毒理實驗室并應用于濫用藥物檢(jian)測(ce)和治(zhi)療藥物監(jian)測(ce)，臨床質譜(pu)檢(jian)測(ce)開(kai)始萌(meng)芽。1988年，美國(guo)聯邦(bang)藥品檢(jian)驗局(ju)發布強制性(xing)指南，要(yao)(yao)求(qiu)治(zhi)療藥物監(jian)測(ce)必須使(shi)(shi)用質譜(pu)法(fa)進(jin)行(xing)確認，奠(dian)定了質譜(pu)技(ji)術在(zai)治(zhi)療藥物監(jian)測(ce)中的重(zhong)要(yao)(yao)地位[2]。
隨著GC-MS在醫學檢(jian)驗領域應(ying)用(yong)的(de)逐(zhu)步增多，免疫法(fa)用(yong)于(yu)類(lei)固(gu)醇激素檢(jian)測(ce)的(de)缺(que)點(dian)也日益凸(tu)顯，尤其是(shi)在測(ce)定婦女和(he)兒童(tong)體內(nei)低(di)濃度睪酮時。但因GC-MS主(zhu)要適用(yong)于(yu)揮發(fa)性和(he)熱穩定性化合物，樣(yang)品制(zhi)備程序(xu)復雜，檢(jian)測(ce)通(tong)量低(di)，因此限制(zhi)了其在臨床中(zhong)的(de)應(ying)用(yong)。20世紀(ji)80年代，快原子轟擊(ji)、電(dian)噴霧和(he)輔助激光解析等“軟電(dian)離”技(ji)術的(de)發(fa)展(zhan)(zhan)，使蛋白質(zhi)、酶、核酸等生物大(da)分子的(de)檢(jian)測(ce)成為可能，大(da)大(da)拓展(zhan)(zhan)了質(zhi)譜技(ji)術在醫學檢(jian)驗領域的(de)應(ying)用(yong)范(fan)圍[1]。
20世紀(ji)90年代(dai)，串(chuan)聯質譜(pu)(pu)技(ji)(ji)術開(kai)始應用于新生(sheng)兒篩查(cha)。而電(dian)(dian)噴霧電(dian)(dian)離(li)接口技(ji)(ji)術 (electrospray ionization interface technology, ESI) 發展使得(de)兩種(zhong)強有力(li)的(de)分(fen)析工具—液相(xiang)(xiang)(xiang)系統(tong)(tong)和(he)(he)質譜(pu)(pu)系統(tong)(tong)的(de)結合成為了(le)(le)(le)(le)可能，兩者的(de)結合也進(jin)一步促進(jin)了(le)(le)(le)(le)液相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)-串(chuan)聯質譜(pu)(pu) (liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS) 技(ji)(ji)術在(zai)醫學檢(jian)(jian)驗(yan)、臨床研究及(ji)疾病診斷的(de)應用發展。液相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)質譜(pu)(pu)技(ji)(ji)術的(de)聯用能夠使非揮發性和(he)(he)熱不(bu)穩定生(sheng)物分(fen)子電(dian)(dian)離(li)并在(zai)極(ji)低的(de)濃度(du)下得(de)到檢(jian)(jian)測(ce)，簡化(hua)了(le)(le)(le)(le)樣品制備流(liu)程，提(ti)高了(le)(le)(le)(le)檢(jian)(jian)測(ce)通量，極(ji)大縮(suo)短(duan)了(le)(le)(le)(le)報(bao)告周期，因而在(zai)臨床實驗(yan)室的(de)常規檢(jian)(jian)測(ce)工作(zuo)中得(de)到了(le)(le)(le)(le)迅猛的(de)發展。
21世紀(ji)初期，質(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)(shu)(shu)開(kai)始(shi)嘗試應用(yong)于(yu)感(gan)(gan)染性(xing)疾病(bing)的(de)(de)(de)檢測，如血源性(xing)感(gan)(gan)染疾病(bing)的(de)(de)(de)分(fen)子診斷。基質(zhi)輔助(zhu)激光解吸電離技術(shu)(shu)(shu) (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 的(de)(de)(de)發展則完美地實(shi)現了(le)生物(wu)大分(fen)子的(de)(de)(de)軟(ruan)離子化(hua)，通過引入基質(zhi)分(fen)子，使(shi)待測分(fen)子不(bu)(bu)產生碎片，解決了(le)非揮發性(xing)和熱不(bu)(bu)穩定(ding)性(xing)生物(wu)大分(fen)子解吸離子化(hua)的(de)(de)(de)問題(ti)，便捷(jie)地將生物(wu)樣本引入質(zhi)譜(pu)(pu)系統，并(bing)結(jie)合(he)飛行(xing)時(shi)間質(zhi)量分(fen)析器(qi) (time-of-flight, TOF) 技術(shu)(shu)(shu)，實(shi)現了(le)微(wei)(wei)生物(wu)的(de)(de)(de)快速鑒(jian)定(ding)分(fen)析，鑒(jian)定(ding)時(shi)間可縮短(duan)1.45d。相對(dui)于(yu)傳統的(de)(de)(de)微(wei)(wei)生物(wu)檢測方法，MALDI-TOF可節省人力和時(shi)間，該應用(yong)也(ye)促(cu)進了(le)質(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)(shu)(shu)在(zai)大分(fen)子檢測領(ling)域的(de)(de)(de)廣泛使(shi)用(yong)，將質(zhi)譜(pu)(pu)的(de)(de)(de)應用(yong)推上了(le)一(yi)個新(xin)的(de)(de)(de)臺(tai)階。
2013年，美國食(shi)品(pin)藥(yao)品(pin)監督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 首次認可使用(yong)MALDI-TOF對(dui)微生物進行(xing)鑒定(ding)。另外，近幾年還出現了將質譜技術(shu)(shu)用(yong)于(yu)實時指導癌癥外科手術(shu)(shu)的(de)前沿應用(yong)[2,5]。
在(zai)我國，質譜技(ji)術(shu)在(zai)醫學(xue)檢驗(yan)中的應用最早也始(shi)于(yu)治療(liao)藥(yao)物監測。隨(sui)后，質譜技(ji)術(shu)在(zai)遺傳代(dai)謝病檢測、營(ying)養素檢測和微生物鑒定工作中作出的突(tu)出貢(gong)獻，引起(qi)行業內的廣泛關(guan)注。同時(shi)其在(zai)蛋(dan)白組學(xue)等研(yan)究領域(yu)也具有良好(hao)的前景，有望成為醫學(xue)檢驗(yan)領域(yu)繼基因測序技(ji)術(shu)之后的下(xia)一個革命性技(ji)術(shu)。
二(er)、質譜技術在醫(yi)學檢驗中(zhong)的主要應用
1、質譜技術在(zai)臨(lin)床生化檢(jian)驗中的(de)應(ying)用(yong)
質譜技術(shu)在應用較早的(de)國家已成(cheng)為繼免(mian)疫學方(fang)法(fa)和(he)化學發光法(fa)之后的(de)第三大生(sheng)化檢測技術(shu)。目前(qian)采用質譜技術(shu)檢測的(de)項(xiang)目數量(liang)雖然與其他兩種方(fang)法(fa)相比還有很大差距，但越(yue)來越(yue)多的(de)生(sheng)化檢測項(xiang)目正(zheng)被轉移至質譜技術(shu)平臺進行檢測;質譜技術(shu)也成(cheng)為生(sheng)化檢驗領域新興的(de)發展方(fang)向(xiang)和(he)不(bu)可(ke)或缺的(de)重(zhong)要技術(shu)[6]。
質譜(pu)技術在臨床(chuang)生(sheng)(sheng)化(hua)檢(jian)(jian)驗中應(ying)用(yong)最為成熟的(de)項目主要包括：生(sheng)(sheng)化(hua)遺傳(chuan)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)、治療藥物監測(ce)(ce)(ce)(ce)、類(lei)固(gu)醇(chun)激(ji)素(su)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)、營(ying)養素(su)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)以及毒(du)理學檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)。技術高(gao)特(te)異性(xing)的(de)特(te)點可(ke)有效避免結(jie)構(gou)類(lei)似物對檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)結(jie)果的(de)影響，為臨床(chuang)提(ti)(ti)供更(geng)準(zhun)確的(de)結(jie)果，提(ti)(ti)高(gao)患者的(de)依(yi)從性(xing)。技術高(gao)靈敏度(du)的(de)特(te)點可(ke)在很大程度(du)上彌補(bu)內分泌類(lei)固(gu)醇(chun)激(ji)素(su)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)中，低濃度(du)化(hua)合物檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)困難和(he)測(ce)(ce)(ce)(ce)不準(zhun)的(de)難題，為疾(ji)病的(de)預測(ce)(ce)(ce)(ce)和(he)診療分型(xing)提(ti)(ti)供準(zhun)確結(jie)果。
國外許多(duo)內分泌實(shi)驗室已經(jing)將大(da)部分體(ti)內激素類(lei)物(wu)質(zhi)(zhi)的(de)檢(jian)測(ce)由放射免疫(yi)學(xue)方(fang)(fang)法(fa)或免疫(yi)學(xue)方(fang)(fang)法(fa)轉(zhuan)換為LC-MS/MS方(fang)(fang)法(fa)，并將質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)技(ji)術作為內分泌類(lei)固醇激素類(lei)物(wu)質(zhi)(zhi)檢(jian)測(ce)的(de)首(shou)選(xuan)方(fang)(fang)法(fa)。質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)技(ji)術一(yi)次(ci)可(ke)(ke)檢(jian)測(ce)多(duo)種(zhong)化(hua)(hua)合物(wu)的(de)特(te)點，可(ke)(ke)提(ti)高(gao)檢(jian)測(ce)通(tong)量、減少樣品(pin)用量和降低(di)檢(jian)測(ce)成(cheng)本(ben)。如在生化(hua)(hua)遺傳(chuan)檢(jian)測(ce)中(zhong)(zhong)(zhong)，質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)技(ji)術一(yi)次(ci)可(ke)(ke)分析60多(duo)種(zhong)氨基(ji)酸(suan)(suan)和酰基(ji)肉堿，篩(shai)查40余種(zhong)新生兒遺傳(chuan)代謝(xie)病;在營(ying)養素檢(jian)測(ce)中(zhong)(zhong)(zhong)一(yi)次(ci)可(ke)(ke)分析20種(zhong)氨基(ji)酸(suan)(suan)、20種(zhong)脂肪酸(suan)(suan)、10余種(zhong)微量元素或5種(zhong)脂溶性維生素，有效(xiao)提(ti)高(gao)了檢(jian)測(ce)通(tong)量、減少了樣品(pin)用量，并提(ti)供了豐富的(de)檢(jian)測(ce)信息;在毒理學(xue)檢(jian)測(ce)中(zhong)(zhong)(zhong)一(yi)次(ci)可(ke)(ke)檢(jian)測(ce)尿液(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)19種(zhong)藥物(wu)，實(shi)現(xian)了高(gao)通(tong)量、快速高(gao)效(xiao)的(de)藥物(wu)篩(shai)查技(ji)術[7]。
在臨床(chuang)生化檢驗領域，質譜技術(shu)相(xiang)比于傳統方法的優(you)勢較為(wei)突出(chu)，但隨著技術(shu)的深(shen)入應(ying)用(yong)與經驗的積(ji)累(lei)，技術(shu)應(ying)用(yong)的缺(que)點也(ye)逐(zhu)步凸顯出(chu)來，包(bao)括(kuo)質譜技術(shu)應(ying)用(yong)的陷阱(jing)問(wen)題、實驗室日常運行過程(cheng)中的管理問(wen)題以及相(xiang)關政策法規問(wen)題等，主要體現(xian)在：
(1) 質(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)在分(fen)析(xi)基質(zhi)復雜的生(sheng)物樣(yang)本(ben)時(shi)，檢測結果(guo)易受到基質(zhi)效應、結構類(lei)似物干(gan)擾(rao)以及質(zhi)譜(pu)(pu)信(xin)號產生(sheng)的不穩定所(suo)帶來的干(gan)擾(rao)影響;對這些問(wen)題認識和(he)預(yu)防不當，則質(zhi)譜(pu)(pu)的檢測結果(guo)將(jiang)存在較大的錯誤風(feng)險(xian);
(2) 質譜技術相比于免疫學方(fang)法(fa)和化學發光法(fa)，檢測的自動化程度較(jiao)低，對(dui)人(ren)員(yuan)依賴性較(jiao)大;同時各廠家儀器(qi)系(xi)統還未實(shi)(shi)(shi)現與臨床實(shi)(shi)(shi)驗室信息管理系(xi)統 (LIS) 的接口雙向對(dui)接，在(zai)數據處理和報告發放環(huan)節，仍未實(shi)(shi)(shi)現自動化;
(3) 對于質(zhi)譜技術應用(yong)較(jiao)成(cheng)熟的項目，檢測數據仍缺(que)乏統一(yi)的應用(yong)標準(zhun)[4];
(4) 質(zhi)譜技術檢測(ce)方法所需(xu)的(de)標(biao)準物質(zhi)、試(shi)劑和耗材(cai)等，目(mu)(mu)前(qian)主要依賴(lai)于(yu)進口(kou)，較(jiao)多的(de)檢測(ce)項目(mu)(mu)受限(xian)于(yu)這(zhe)些因(yin)素而(er)開展受阻;
(5) 目前質譜實驗室的方法基本為自建方法，標準化和規范化較為薄弱。美國臨床醫(yi)學實驗室認可標準化協會已發布了臨床質譜的使用指南[8]，中華醫學會檢驗醫學分會、衛生計生委臨床檢驗中心和《中華檢驗醫學雜志》編輯部也于2017年10月份共同發布了《液相色譜-質譜臨床應用建議》[9]，這些都為質譜技術臨床檢測工作提供良好了的指導和參考;
(6) 由于質(zhi)譜(pu)技(ji)術較(jiao)(jiao)為復雜，儀器構成多樣化，在實際的(de)(de)應(ying)用過(guo)程中，需要(yao)(yao)有經(jing)驗的(de)(de)專業技(ji)術人才進行規范(fan)的(de)(de)使用操作(zuo)，但目前國內相(xiang)關的(de)(de)技(ji)術人才匱乏;質(zhi)譜(pu)實驗室的(de)(de)儀器設(she)備昂貴，對于安裝條件有特殊要(yao)(yao)求，建設(she)需要(yao)(yao)投入(ru)大量的(de)(de)資金(jin);這些(xie)使得質(zhi)譜(pu)技(ji)術臨床應(ying)用的(de)(de)門檻較(jiao)(jiao)高(gao)，一定程度(du)上(shang)限制了技(ji)術的(de)(de)應(ying)用;
(7) 在日常(chang)運(yun)營過程中儀器(qi)的(de)(de)維(wei)修(xiu)服務成本較高(gao)，維(wei)修(xiu)周期較長，維(wei)修(xiu)的(de)(de)及時性(xing)(xing)也(ye)存在不能(neng)滿(man)足臨床檢測的(de)(de)報告(gao)周期固定性(xing)(xing)的(de)(de)要求;
(8) 國內(nei)對于質譜技術(shu)在臨床的應用監管(guan)還不成熟，相關(guan)的檢(jian)測(ce)項目在臨床上無(wu)收費標(biao)準，也在一(yi)定程度上限制(zhi)了技術(shu)的應用普及。
雖(sui)然質(zhi)譜(pu)(pu)(pu)技(ji)術的(de)(de)應用(yong)仍(reng)存在較多缺(que)陷，但隨著技(ji)術的(de)(de)革新與發(fa)(fa)展，應用(yong)監管的(de)(de)成熟，各項(xiang)瓶頸將被不斷突(tu)破(po)，未(wei)來隨著質(zhi)譜(pu)(pu)(pu)儀器的(de)(de)各項(xiang)性能的(de)(de)提升;前處理自(zi)動化(hua)的(de)(de)實現;檢(jian)(jian)測(ce)數據自(zi)動輸出并實現與實驗室信息系統的(de)(de)雙(shuang)向對接，以及結(jie)果報告自(zi)動預(yu)警功能的(de)(de)實現，質(zhi)譜(pu)(pu)(pu)儀有望像免(mian)疫(yi)學(xue)方法和(he)化(hua)學(xue)發(fa)(fa)光法一樣，成為臨床(chuang)生(sheng)化(hua)檢(jian)(jian)驗中自(zi)動化(hua)、智能化(hua)、易用(yong)化(hua)的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)平臺。
2、質(zhi)譜(pu)技術在微生(sheng)物檢驗中的(de)應(ying)用
近年(nian)來，MALDI-TOF技術(shu)(shu)已(yi)成功應用于(yu)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)鑒(jian)(jian)定(ding)及分型，并逐漸成為微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)鑒(jian)(jian)定(ding)的(de)(de)(de)主流技術(shu)(shu)，可快速檢測和鑒(jian)(jian)定(ding)革(ge)蘭(lan)陽(yang)性(xing)菌(jun)(jun)(jun)、革(ge)蘭(lan)陰性(xing)菌(jun)(jun)(jun)、厭氧菌(jun)(jun)(jun)、分枝桿(gan)菌(jun)(jun)(jun)、酵母菌(jun)(jun)(jun)和絲狀真菌(jun)(jun)(jun)等[6,10-14]。相比于(yu)傳(chuan)統的(de)(de)(de)革(ge)蘭(lan)染色、菌(jun)(jun)(jun)落形態(tai)、表(biao)型鑒(jian)(jian)定(ding)及分子生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)學技術(shu)(shu)， MALDI-TOF技術(shu)(shu)具有快速、準確、經濟、高通(tong)量等優點。MALDI-TOF是基(ji)于(yu)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)表(biao)面蛋白(bai)分子檢測的(de)(de)(de)技術(shu)(shu)，通(tong)過(guo)測定(ding)未知微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)自身獨特(te)的(de)(de)(de)蛋白(bai)質指紋(wen)圖(tu)(tu)譜(pu)及特(te)征性(xing)的(de)(de)(de)圖(tu)(tu)譜(pu)峰，并與數據(ju)庫中參考(kao)菌(jun)(jun)(jun)株的(de)(de)(de)蛋白(bai)指紋(wen)圖(tu)(tu)譜(pu)進行(xing)比對(dui)，從而實現菌(jun)(jun)(jun)株的(de)(de)(de)鑒(jian)(jian)定(ding)[11]。
該技(ji)術是將(jiang)完整(zheng)的(de)微(wei)生物(wu)(wu)細(xi)胞直接(jie)進(jin)行檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)，樣品制備簡單(dan)，檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)周轉時(shi)間短，在數分(fen)鐘內(nei)就可(ke)以(yi)(yi)得到(dao)(dao)一個(ge)菌(jun)(jun)種(zhong)(zhong)的(de)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)試結(jie)果(guo)，且分(fen)析(xi)用(yong)菌(jun)(jun)量(liang)極(ji)少，而傳(chuan)統(tong)方(fang)法(fa)完成常規細(xi)菌(jun)(jun)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)至少需(xu)要8~18h或更長時(shi)間。MALDI-TOF通過檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)細(xi)菌(jun)(jun)胞膜成分(fen)或表達的(de)特異蛋白(bai)對細(xi)菌(jun)(jun)進(jin)行種(zhong)(zhong)群(qun)的(de)鑒(jian)(jian)(jian)別，敏(min)(min)感性和(he)準(zhun)確(que)(que)性高(gao)，可(ke)以(yi)(yi)區分(fen)表型相似或相同的(de)菌(jun)(jun)株(zhu)，提供屬、種(zhong)(zhong)、型水平的(de)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)，對臨床常見分(fen)離菌(jun)(jun)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)到(dao)(dao)種(zhong)(zhong)水平的(de)準(zhun)確(que)(que)率(lv)很高(gao)。以(yi)(yi)16S r RNA基因測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序結(jie)果(guo)為(wei)標準(zhun)，質譜檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)結(jie)果(guo)準(zhun)確(que)(que)率(lv)為(wei)90.0%~95.0%[15]，不僅可(ke)以(yi)(yi)識別病(bing)(bing)原菌(jun)(jun)，而且有助(zhu)于(yu)發現新的(de)病(bing)(bing)原菌(jun)(jun)。此外，質譜技(ji)術還用(yong)于(yu)病(bing)(bing)原體的(de)藥(yao)物(wu)(wu)敏(min)(min)感性檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)，常規的(de)藥(yao)物(wu)(wu)敏(min)(min)感性實驗方(fang)法(fa)比較費時(shi)，局限于(yu)少數細(xi)菌(jun)(jun)，MALDI-TOF通過比對耐(nai)(nai)藥(yao)菌(jun)(jun)株(zhu)和(he)藥(yao)物(wu)(wu)敏(min)(min)感菌(jun)(jun)株(zhu)間的(de)特征性蛋白(bai)和(he)圖譜峰(feng)及檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)耐(nai)(nai)藥(yao)菌(jun)(jun)株(zhu)與抗(kang)生素(su)共(gong)培養后的(de)分(fen)解產物(wu)(wu)，可(ke)以(yi)(yi)分(fen)析(xi)幾乎(hu)所(suo)有的(de)耐(nai)(nai)藥(yao)機制。
研(yan)究表明(ming)，相比于(yu)(yu)標(biao)(biao)準的(de)(de)(de)微生物(wu)(wu)培養技術，質(zhi)(zhi)譜(pu)技術可降(jiang)低約(yue)50%的(de)(de)(de)試劑(ji)成本(ben)(ben)和勞動(dong)力成本(ben)(ben)[16]。但是，MALDI-TOF作為(wei)一項新(xin)興技術，在(zai)(zai)微生物(wu)(wu)鑒(jian)定方(fang)面也存在(zai)(zai)著一定的(de)(de)(de)局限性。如對(dui)(dui)于(yu)(yu)具有(you)特(te)殊結構的(de)(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)種和圖譜(pu)極為(wei)相似的(de)(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)種的(de)(de)(de)鑒(jian)定區(qu)分(fen)存在(zai)(zai)一定的(de)(de)(de)難(nan)度(du)、對(dui)(dui)于(yu)(yu)一些罕見(jian)菌(jun)(jun)(jun)種或新(xin)型細菌(jun)(jun)(jun)鑒(jian)定困(kun)難(nan)、對(dui)(dui)血培養樣本(ben)(ben)中的(de)(de)(de)混合菌(jun)(jun)(jun)種難(nan)以(yi)準確(que)鑒(jian)別(bie)等，原因(yin)是質(zhi)(zhi)譜(pu)數據(ju)庫中標(biao)(biao)準菌(jun)(jun)(jun)株的(de)(de)(de)圖譜(pu)有(you)限、質(zhi)(zhi)譜(pu)峰的(de)(de)(de)數據(ju)不充分(fen)以(yi)及細菌(jun)(jun)(jun)庫中無(wu)這些菌(jun)(jun)(jun)株[17,18]。
隨著儀器技術參數(shu)、質譜(pu)數(shu)據庫及(ji)分析軟(ruan)件(jian)的不(bu)斷(duan)更(geng)新完善，所有(you)的分離株(zhu)將被(bei)逐步的明(ming)確鑒定(ding)出來。因(yin)此，隨著質譜(pu)技術在臨床微(wei)生(sheng)物實驗室的應用(yong)數(shu)據庫進一步完善，MALDI-TOF技術必(bi)將在微(wei)生(sheng)物鑒定(ding)、菌種(zhong)分型(xing)、同源分析、耐藥(yao)監測等多方面發揮出更(geng)大作用(yong)，有(you)望成為新一代病原微(wei)生(sheng)物診斷(duan)的常(chang)規(gui)技術。
3、質譜技術(shu)在核酸檢測中的應(ying)用
核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)質(zhi)(zhi)(zhi)譜檢(jian)(jian)測(ce)(ce)技術是在MALDI-TOF原理的(de)基(ji)礎上，結合(he)引物(wu)延伸分(fen)(fen)析(xi)法和(he)(he)堿基(ji)特(te)異(yi)裂解(jie)分(fen)(fen)析(xi)法，針對雙(shuang)鏈DNA的(de)特(te)性進行了特(te)殊優化(hua)，使樣(yang)品在電離(li)(li)過程(cheng)中(zhong)不產生(sheng)(sheng)或產生(sheng)(sheng)較少的(de)碎(sui)片離(li)(li)子，可用于(yu)(yu)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)的(de)分(fen)(fen)子量和(he)(he)研(yan)究基(ji)因組(zu)單核(he)(he)苷酸(suan)(suan)(suan)多(duo)態性 (single nucleotide polymorphism, SNP) ，是近年(nian)來(lai)應(ying)用于(yu)(yu)臨床核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)的(de)新型(xing)軟電離(li)(li)生(sheng)(sheng)物(wu)質(zhi)(zhi)(zhi)譜[19]。相(xiang)比于(yu)(yu)以凝膠電泳為基(ji)礎的(de)測(ce)(ce)序(xu)法，質(zhi)(zhi)(zhi)譜技術具有分(fen)(fen)辨率高、分(fen)(fen)離(li)(li)速度快、雜質(zhi)(zhi)(zhi)干擾少的(de)優點，被廣泛應(ying)用于(yu)(yu)核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)測(ce)(ce)序(xu)、核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)指紋(wen)圖譜、核(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)SNP分(fen)(fen)析(xi)等(deng)[20]。
SNP是(shi)指基(ji)(ji)因(yin)組DNA序(xu)列上某個(ge)(ge)(ge)位(wei)置單個(ge)(ge)(ge)核苷酸堿基(ji)(ji)的(de)差(cha)異，即基(ji)(ji)因(yin)位(wei)點(dian)的(de)突(tu)變(bian)，在人群中的(de)發生頻率大于(yu)1%，是(shi)決定個(ge)(ge)(ge)體疾病(bing)易感性和(he)藥(yao)(yao)物反(fan)應性差(cha)異的(de)重要因(yin)素(su)，通過分析突(tu)變(bian)的(de)位(wei)點(dian)，可(ke)預測疾病(bing)，并提供診斷意見和(he)指導用(yong)藥(yao)(yao)。MALDI-TOF分析檢測SNP是(shi)根(gen)據不(bu)同的(de)分子量將等位(wei)基(ji)(ji)因(yin)排(pai)序(xu)，區分和(he)鑒別相(xiang)對分子量達7000左右 (含20多個(ge)(ge)(ge)堿基(ji)(ji)) 、僅存(cun)在1個(ge)(ge)(ge)堿基(ji)(ji)差(cha)別的(de)不(bu)同DNA，可(ke)以精準地分辨(bian)到(dao)堿基(ji)(ji)種類。
藥物(wu)(wu)(wu)代(dai)謝酶遺傳(chuan)多態性(xing)(xing)是產生藥物(wu)(wu)(wu)毒副(fu)作用(yong)(yong)、降低或喪失藥物(wu)(wu)(wu)療效的主要(yao)原(yuan)因(yin)之一，通(tong)過檢測(ce)(ce)藥物(wu)(wu)(wu)代(dai)謝酶的基(ji)(ji)因(yin)型可(ke)對臨(lin)床(chuang)(chuang)用(yong)(yong)藥方(fang)案進行(xing)指導和調(diao)整，為臨(lin)床(chuang)(chuang)個體化用(yong)(yong)藥提(ti)(ti)供依據。以(yi)往(wang)檢測(ce)(ce)藥物(wu)(wu)(wu)代(dai)謝酶基(ji)(ji)因(yin)多態性(xing)(xing)通(tong)常采用(yong)(yong)化學法(fa)，依賴于核苷(gan)酸的互補性(xing)(xing)對核酸序列進行(xing)分(fen)析，對于序列的長(chang)度、復雜(za)性(xing)(xing)、反應條件等都具有較高(gao)的要(yao)求，容(rong)易(yi)受到不同程度的化學因(yin)素干擾，導致檢測(ce)(ce)結果出現偏差(cha)。若(ruo)能將化學和物(wu)(wu)(wu)理方(fang)法(fa)結合起來對藥物(wu)(wu)(wu)代(dai)謝酶基(ji)(ji)因(yin)進行(xing)檢測(ce)(ce)，將極大提(ti)(ti)高(gao)檢測(ce)(ce)結果的準確性(xing)(xing)。
MALDI-TOF是藥(yao)(yao)物代謝酶(mei)基因(yin)多態性的新型檢(jian)測方法，其(qi)根據核苷(gan)酸(suan)分(fen)子(zi)(zi)被(bei)電離后在真空管(guan)中的飛行時間來確定(ding)其(qi)分(fen)子(zi)(zi)量(liang)大小，最(zui)終確定(ding)核苷(gan)酸(suan)序(xu)列，檢(jian)測結果(guo)(guo)(guo)僅僅依賴(lai)于核酸(suan)分(fen)子(zi)(zi)量(liang)。經過驗(yan)證比較，MALDI-TOF檢(jian)測結果(guo)(guo)(guo)與(yu)Sanger測序(xu)的結果(guo)(guo)(guo)符合率(lv)為100%[21,22]。傳統的Sanger測序(xu)方法雖(sui)然是序(xu)列測定(ding)的金標準，但其(qi)操作(zuo)步驟(zou)繁瑣費(fei)時和試劑成本高(gao)等限(xian)制(zhi)了其(qi)臨床應用。MALDI-TOF可(ke)通過一次(ci)實驗(yan)檢(jian)測多個標本的多個突(tu)變(bian)，實現基因(yin)型的高(gao)通量(liang)、快速檢(jian)測，為個體(ti)化用藥(yao)(yao)提供更加多樣化的檢(jian)測手段。
4、質譜技術(shu)在蛋白質組學中(zhong)的應用
質(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)可檢測蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)氨基酸組(zu)成、分子量、多(duo)肽(tai)(tai)或(huo)二硫(liu)鍵(jian)的(de)(de)(de)(de)數目與(yu)位置及蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)空間構象等，從而實現未(wei)知(zhi)肽(tai)(tai)段的(de)(de)(de)(de)篩選、測序、肽(tai)(tai)指紋圖(tu)譜(pu)(pu)、蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)表(biao)達譜(pu)(pu)、蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)翻譯后修飾(shi)譜(pu)(pu)、全蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)完(wan)整無損分析等。質(zhi)譜(pu)(pu)多(duo)樣化的(de)(de)(de)(de)前端連接方式極大地促(cu)進(jin)了(le)研究(jiu)者對(dui)基礎蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)科學領域的(de)(de)(de)(de)認(ren)識，但將這(zhe)些認(ren)識轉變為對(dui)臨床(chuang)實踐的(de)(de)(de)(de)有(you)效(xiao)信息(xi)則有(you)相當大的(de)(de)(de)(de)難度。到目前為止，基于質(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)的(de)(de)(de)(de)將蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)組(zu)學多(duo)樣性的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)和多(duo)肽(tai)(tai)標志物， 成功應用(yong)于臨床(chuang)檢測的(de)(de)(de)(de)案例并不(bu)多(duo)見[22]。
相反，對(dui)于(yu)已知(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)、確定的(de)(de)(de)(de)(de)多肽和蛋白(bai)標志(zhi)物(wu)即(ji)目標蛋白(bai)組學，質(zhi)譜(pu)技術(shu)得到了較(jiao)(jiao)好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)應(ying)用(yong)。目前，已經(jing)有一(yi)些(xie)關于(yu)LC-MS/MS用(yong)于(yu)臨床(chuang)目標多肽和蛋白(bai)分析(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)文章發表，如甲狀腺球蛋白(bai) (Tg) 和淀粉樣蛋白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)鑒定與定量分析(xi)等[23-25]。質(zhi)譜(pu)技術(shu)在這一(yi)領域的(de)(de)(de)(de)(de)應(ying)用(yong)，在很多情況下均(jun)可(ke)為(wei)臨床(chuang)提供有價(jia)值(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)信息[21]，如對(dui)某(mou)一(yi)分析(xi)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)學方(fang)法(fa)不存(cun)在時(shi)(shi);已經(jing)存(cun)在的(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)學方(fang)法(fa)不能給出某(mou)些(xie)臨床(chuang)關鍵問(wen)題的(de)(de)(de)(de)(de)答案時(shi)(shi);已經(jing)存(cun)在的(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)學方(fang)法(fa)存(cun)在干擾時(shi)(shi);某(mou)一(yi)分析(xi)物(wu)存(cun)在多個(ge)異構體時(shi)(shi);對(dui)同一(yi)分析(xi)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測，不同的(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測方(fang)法(fa)間(jian)存(cun)在較(jiao)(jiao)大的(de)(de)(de)(de)(de)結果變(bian)異性時(shi)(shi);已經(jing)存(cun)在的(de)(de)(de)(de)(de)分析(xi)方(fang)法(fa)流程較(jiao)(jiao)為(wei)復雜時(shi)(shi)，質(zhi)譜(pu)技術(shu)均(jun)可(ke)發揮相應(ying)作用(yong)，彌補免疫(yi)(yi)學方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)不足。
質(zhi)(zhi)譜技(ji)術在醫(yi)學檢驗領域中應用的(de)下個目標和(he)挑戰，是如何彌補(bu)免疫學方法在蛋(dan)白和(he)多(duo)肽檢測(ce)方面(mian)的(de)局限(xian)性。相(xiang)信(xin)隨著技(ji)術的(de)發展，這方面(mian)的(de)突(tu)破(po)會越(yue)來越(yue)多(duo)，為臨(lin)床提(ti)供(gong)更多(duo)的(de)有(you)價值的(de)質(zhi)(zhi)譜檢測(ce)數據。
