與化(hua)學仿制(zhi)藥相比，生物類似藥雖(sui)然(ran)也屬于(yu)仿制藥范疇，但其不僅投資門檻(jian)更(geng)高，技術門檻(jian)也更(geng)高。

　　三大技術門檻

　　生物類似藥的技術門檻高至少表現在三大方面：

　　一(yi)是有(you)關(guan)生(sheng)產(chan)、制造過(guo)程(cheng)(cheng)和工藝流(liu)程(cheng)(cheng)。在產(chan)品生(sheng)產(chan)過(guo)程(cheng)(cheng)中，有(you)多種因素可(ke)能會(hui)影(ying)響到生(sheng)物類似(si)藥的(de)(de)質量，如分子設計、表(biao)達系(xi)統、細胞(bao)株類型、翻譯后(hou)修飾(PTM)、不(bu)純物和污染物、配方(fang)和輔料、包裝容器、生(sheng)產(chan)過(guo)程(cheng)(cheng)中的(de)(de)蛋(dan)白降解等。

　　二是對生(sheng)物(wu)類似藥(yao)在質(zhi)量、安全性(xing)和有效性(xing)(QSE)等方面進行分(fen)析(xi)檢測、表(biao)征，需要在臨床試驗前在蛋白(bai)的(de)多(duo)種性(xing)質(zhi)上與原(yuan)研(yan)藥(yao)參考品一(yi)致。這(zhe)種一(yi)致性(xing)，根據歐盟EMA的(de)要求需要“相(xiang)似”(similar)。而根據美國FDA的(de)要求則需要“高(gao)(gao)度(du)相(xiang)似”(highly similar)。如果是可以自動替換(interchangeable)的(de)生(sheng)物(wu)類似藥(yao)，其要求更高(gao)(gao)。

　　上面兩(liang)大高(gao)門檻對于(yu)中國藥企(qi)而言更是(shi)(shi)意味著投(tou)資的高(gao)門檻，因為(wei)無(wu)論是(shi)(shi)上下游的工藝開(kai)發、生產(chan)還(huan)是(shi)(shi)分析方法開(kai)發、質量檢(jian)測(ce)，所需(xu)儀器設備甚至耗材幾乎都需(xu)要(yao)進(jin)口。

　　第(di)三個(ge)方面(mian)是生物原研(yan)藥(yao)的(de)專(zhuan)(zhuan)利壁壘。生物藥(yao)的(de)專(zhuan)(zhuan)利要遠比(bi)化(hua)學(xue)藥(yao)復雜，這個(ge)高門檻很(hen)容易被投資人忽視。艾伯維(wei)(Abbvie)和(he)安進(jin)(Amgen)因Humira(修美樂)的(de)生物類似(si)藥(yao)的(de)專(zhuan)(zhuan)利之戰僅(jin)僅(jin)是一個(ge)例子。現在風頭(tou)正勁的(de)免疫腫(zhong)(zhong)瘤抗(kang)體藥(yao)(尤(you)其是已(yi)經上市(shi)的(de)兩個(ge)PD-1抗(kang)體藥(yao))以后很(hen)可能成為被仿制的(de)熱點(dian)目標(biao)，但(dan)免疫腫(zhong)(zhong)瘤領域近期多起專(zhuan)(zhuan)利訴訟也說明：即使是做原研(yan)生物藥(yao)，專(zhuan)(zhuan)利問題也需要防范。

　　出于(yu)工作關系和(he)(he)個(ge)人(ren)興(xing)趣，筆者(zhe)本(ben)文僅談談生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)類(lei)(lei)似(si)藥的(de)分(fen)析技(ji)(ji)術(shu)。如(ru)表格所示，生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)類(lei)(lei)似(si)藥的(de)表征分(fen)析，涉及許多(duo)(duo)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)化(hua)學和(he)(he)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)物(wu)理技(ji)(ji)術(shu)，筆者(zhe)對(dui)于(yu)大多(duo)(duo)數技(ji)(ji)術(shu)略知一二，本(ben)文無意具(ju)體談這些(xie)分(fen)析技(ji)(ji)術(shu)的(de)細節和(he)(he)難(nan)度，而只是通過簡單評論(lun)這些(xie)技(ji)(ji)術(shu)手段(duan)，試圖說明進入生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)類(lei)(lei)似(si)藥的(de)門檻很高。

　　質(zhi)控(kong)蛋白三大性質(zhi)

　　與評價(jia)化學(xue)藥(yao)類(lei)似，對于(yu)生物(wu)藥(yao)的評價(jia)，質(zhi)量、安(an)(an)全性和有效性可以說是(shi)最重要的三個(ge)方面(mian)，而質(zhi)量又是(shi)安(an)(an)全性和有效性的前提和基礎。

　　對(dui)于(yu)生(sheng)物藥的質(zhi)量，FDA認為(wei)治(zhi)療性蛋(dan)白(bai)的三大方面性質(zhi)雖然不能(neng)被完(wan)全充分(fen)測定，但對(dui)于(yu)評價蛋(dan)白(bai)藥是非(fei)常重(zhong)要的，這三大性質(zhi)即：PTM、蛋(dan)白(bai)高(gao)級結(jie)構(gou)和蛋(dan)白(bai)聚集(ji)，下面將分(fen)別簡單介紹(shao)。

　　蛋白(bai)的翻譯后修飾(PTM)

　　蛋白(bai)的翻譯后修飾(PTM)有(you)很多種，常見的包括(kuo)糖基(ji)化(hua)(又可細分為：半乳糖苷基(ji)化(hua)、巖藻(zao)糖基(ji)化(hua)、唾液酸糖苷化(hua)等)、氧化(hua)、磷酸化(hua)、硫酸化(hua)、脂化(hua)、二硫鍵形成和(he)(he)脫(tuo)酰胺。這些(xie)化(hua)學(xue)變化(hua)大多是在(zai)細胞內發生的，但(dan)有(you)些(xie)也可能發生在(zai)生產的各(ge)個階段(duan)(如純(chun)化(hua)和(he)(he)儲存(cun)過程)。

　　現在的(de)科學(xue)研究已(yi)經表明，蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)PTM會(hui)影響蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)活性和免疫原性。蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)PTM還(huan)可能改變蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)結構進(jin)而(er)引起聚集，從而(er)進(jin)一步影響蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)免疫原性。

　　因此，需要在蛋(dan)白(bai)類藥物(wu)(wu)生產(chan)的各(ge)個階(jie)段對(dui)(dui)蛋(dan)白(bai)質(zhi)的PTM進行(xing)檢測(ce)。對(dui)(dui)于單一成分的純化蛋(dan)白(bai)藥，PTM的檢測(ce)和(he)監測(ce)則(ze)相(xiang)對(dui)(dui)容易一些(xie)(xie)。而對(dui)(dui)于含有(you)許多種蛋(dan)白(bai)質(zhi)的復雜混合物(wu)(wu)蛋(dan)白(bai)藥物(wu)(wu)(如(ru)有(you)些(xie)(xie)預(yu)防性疫(yi)苗)，即使是采用蛋(dan)白(bai)質(zhi)組學技術，檢測(ce)所有(you)蛋(dan)白(bai)的PTM也(ye)是非常大(da)的挑戰。

　　研究(jiu)蛋白PTM的(de)最有力的(de)利(li)器當(dang)是生(sheng)物質(zhi)譜(pu)了，主要是基(ji)(ji)于電噴(pen)霧(ESI)和基(ji)(ji)質(zhi)輔助激(ji)光解離(MALDI)兩種技術。近(jin)(jin)年(nian)來，質(zhi)譜(pu)在生(sheng)物類似藥領域的(de)應用明(ming)顯增多，在近(jin)(jin)幾年(nian)的(de)美國質(zhi)譜(pu)協會(hui)會(hui)議上，每年(nian)都有不少口頭報告或(huo)墻報是直接用質(zhi)譜(pu)研究(jiu)生(sheng)物類似藥PTM的(de)，其中糖(tang)基(ji)(ji)化(hua)研究(jiu)占比最大(da)。

　　但(dan)是，由于生(sheng)物(wu)質(zhi)譜價格(ge)昂貴(gui)，動輒幾十萬美(mei)(mei)元，高端(duan)的售價甚(shen)至在(zai)50萬美(mei)(mei)元以上，這也限制了(le)生(sheng)物(wu)質(zhi)譜在(zai)包括生(sheng)物(wu)類似藥在(zai)內的生(sheng)物(wu)制藥領域的應用(yong)。

　　蛋(dan)白的高(gao)級結構

　　蛋白的(de)高級(ji)(ji)結(jie)(jie)構是指蛋白的(de)二級(ji)(ji)、三(san)級(ji)(ji)和(he)(he)四級(ji)(ji)結(jie)(jie)構，這些結(jie)(jie)構特(te)性決定了蛋白的(de)三(san)維空(kong)間結(jie)(jie)構，進(jin)而最終(zhong)決定了蛋白的(de)功能(neng)和(he)(he)活性。因此，比(bi)較生物類似藥(yao)(指蛋白藥(yao))和(he)(he)原研(yan)藥(yao)的(de)蛋白高級(ji)(ji)結(jie)(jie)構，是證明兩只藥(yao)相似的(de)重要手段。

　　X-射線(xian)衍射和(he)核磁共振(zhen)(NMR)是公認(ren)的(de)測定蛋白質三維(wei)空間結(jie)構的(de)兩種最主要的(de)技(ji)術(shu)。但是，對于生(sheng)物類似藥和(he)原研藥的(de)結(jie)構相(xiang)似性研究(jiu)，這兩種技(ji)術(shu)都有很(hen)大的(de)挑(tiao)戰。

　　對(dui)(dui)于X-射線衍射而(er)言，需要耗時(shi)較長的(de)蛋白(bai)結晶過程和數(shu)據(ju)解析(xi)(xi)過程，對(dui)(dui)于樣(yang)品量(liang)較大(da)的(de)工業界(jie)而(er)言，顯然不能滿足高通量(liang)的(de)要求(qiu)。而(er)NMR不但價格昂(ang)貴(gui)、靈敏度相對(dui)(dui)較低、數(shu)據(ju)分析(xi)(xi)耗時(shi)長，對(dui)(dui)于分析(xi)(xi)分子量(liang)達(da)150kDa的(de)大(da)分子抗體藥(yao)也面臨(lin)很大(da)的(de)挑戰，所(suo)以(yi)NMR在(zai)生物類似(si)藥(yao)領域注定應用非常有限。

　　另(ling)外(wai)，還有其它一些(xie)(xie)經(jing)典生物(wu)物(wu)理技(ji)術(shu)被用于表征蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)結(jie)構(gou)，如圓(yuan)二色性(xing)譜(pu)(pu)、傅里(li)葉變(bian)換紅外(wai)光(guang)(guang)譜(pu)(pu)、熒光(guang)(guang)光(guang)(guang)譜(pu)(pu)、差示掃(sao)描量熱法、分析超速離心、排阻色譜(pu)(pu)以及各種(zhong)(zhong)染料(liao)結(jie)合(he)鑒別(bie)技(ji)術(shu)等(deng)。這些(xie)(xie)技(ji)術(shu)一個最(zui)主要的(de)(de)限制，就(jiu)是只能(neng)(neng)檢測(ce)(ce)來自蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)不同部位的(de)(de)某(mou)一種(zhong)(zhong)總(zong)的(de)(de)信號。從這些(xie)(xie)測(ce)(ce)定得到的(de)(de)信息(xi)只能(neng)(neng)得到生物(wu)藥整個結(jie)構(gou)的(de)(de)總(zong)的(de)(de)平均(jun)值。比如：圓(yuan)二色性(xing)譜(pu)(pu)測(ce)(ce)定就(jiu)只能(neng)(neng)表明(ming)某(mou)一種(zhong)(zhong)主要的(de)(de)二級結(jie)構(gou)(阿(a)爾法螺旋、b折(zhe)疊和(he)無規卷曲(qu))的(de)(de)平均(jun)百分比。如果一個含有多(duo)個阿(a)爾法螺旋結(jie)構(gou)的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)，其中只有一個阿(a)爾法螺旋結(jie)構(gou)和(he)另(ling)一蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)相比發生了變(bian)化，但是即使(shi)這一變(bian)化相對較大，被另(ling)外(wai)不變(bian)的(de)(de)阿(a)爾法螺旋平均(jun)以后，圓(yuan)二色性(xing)譜(pu)(pu)所能(neng)(neng)測(ce)(ce)到的(de)(de)變(bian)化也可能(neng)(neng)很(hen)小(xiao)，甚至沒(mei)有可以測(ce)(ce)量出的(de)(de)變(bian)化。所以這些(xie)(xie)經(jing)典生物(wu)物(wu)理技(ji)術(shu)不能(neng)(neng)用于檢測(ce)(ce)生物(wu)藥很(hen)小(xiao)的(de)(de)結(jie)構(gou)變(bian)化。

　　更(geng)靈敏的(de)(de)技(ji)術則是(shi)氫(qing)氘交(jiao)換質(zhi)譜(pu)(HDX-MS)，這(zhe)也進(jin)一步顯示質(zhi)譜(pu)技(ji)術在比較生(sheng)物類(lei)似藥和原研藥結構(gou)方面的(de)(de)重(zhong)要性。現代生(sheng)物質(zhi)譜(pu)技(ji)術在生(sheng)物藥領域的(de)(de)應用已經遠(yuan)不僅僅是(shi)做蛋(dan)白(bai)質(zhi)鑒(jian)定、分子(zi)量測定、氨基酸(suan)序列測定，蛋(dan)白(bai)結構(gou)只是(shi)其(qi)多(duo)種(zhong)新(xin)應用的(de)(de)一個方面。

　　蛋白(bai)聚集

　　蛋白(bai)聚(ju)集(ji)是(shi)蛋白(bai)藥生產(chan)過程中(zhong)很(hen)頭疼的(de)(de)問題，尤其是(shi)對于(yu)高濃度的(de)(de)蛋白(bai)溶液，很(hen)容(rong)易引起蛋白(bai)聚(ju)集(ji)。單體蛋白(bai)的(de)(de)聚(ju)集(ji)過程可以是(shi)可逆的(de)(de)，也可能是(shi)不可逆的(de)(de)，其聚(ju)集(ji)后的(de)(de)大小(xiao)可以從二聚(ju)體到包含上(shang)萬億個蛋白(bai)單體的(de)(de)肉(rou)眼可見的(de)(de)顆粒。

　　總的來(lai)說，蛋(dan)白聚集(ji)對于任(ren)何蛋(dan)白藥都是(shi)問題。蛋(dan)白聚集(ji)不但會降低蛋(dan)白藥的有效劑量，更大的問題是(shi)可能會引起毒副作用和免(mian)疫反應。一般而(er)言，蛋(dan)白分子量越大，其免(mian)疫原性越強。在某(mou)些特殊情況(kuang)下，這(zhe)些難以(yi)預(yu)料的副作用甚至可能是(shi)致(zhi)命的。

　　因(yin)此，蛋白聚(ju)集(ji)必須被檢測、定(ding)量和(he)(he)表(biao)征(zheng)，用以比較生物類似(si)藥和(he)(he)原研藥。如表(biao)中(zhong)所示，表(biao)征(zheng)蛋白聚(ju)集(ji)的主要分析技術包(bao)括(kuo)排阻-高效(壓)液相色(se)譜(SEC-HPLC)、凝(ning)膠(jiao)電泳、分析超速離心、光散(san)射法等。

　　由(you)于(yu)簡(jian)單(dan)、易用(yong)、廉價、快速、樣(yang)品用(yong)量少等特點，SEC-HPLC是目(mu)前檢測蛋白(bai)聚集的最常用(yong)方法(fa)。當然，SEC-HPLC也有自己的缺點，如(ru)較大的蛋白(bai)聚體可能在進樣(yang)上(shang)柱時就被除去，造成(cheng)假陰性。

　　這也進一步說明，沒有(you)任何一種(zhong)(zhong)(zhong)十全十美(mei)的分析技(ji)術(shu)。正(zheng)是緣(yuan)于此，美(mei)國FDA和(he)(he)ICH(國際人用(yong)藥(yao)(yao)注冊技(ji)術(shu)協調會議(yi))都建議(yi)生物(wu)類(lei)似藥(yao)(yao)研發企業(ye)不但(dan)要(yao)檢測(ce)蛋白不同(tong)種(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)(xing)質，也建議(yi)采用(yong)多(duo)種(zhong)(zhong)(zhong)技(ji)術(shu)檢測(ce)同(tong)一種(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)(xing)質，以盡(jin)量得到更全面的生物(wu)類(lei)似藥(yao)(yao)和(he)(he)原研藥(yao)(yao)可以比(bi)較的多(duo)種(zhong)(zhong)(zhong)信息，如(ru)理(li)化性(xing)(xing)質、生物(wu)活性(xing)(xing)、免疫化學(xue)性(xing)(xing)質、純度、不純物(wu)和(he)(he)污染物(wu)等。

　　相似度(du)界定：Case By Case?

　　值得一提的是(shi)，生物類(lei)似藥有兩個常用且易于混淆的概(gai)念：可比(bi)性(comparability)和相似性(similarity)。

　　ICH明確定(ding)義和限制(zhi)“可(ke)比(bi)(bi)性”是指同一家(jia)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)商所(suo)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)的(de)原研藥(yao)(包括批(pi)準上(shang)市后(hou)階段)，在生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)工(gong)藝變化(如放大(da))后(hou)，兩種工(gong)藝所(suo)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)的(de)同一產(chan)(chan)品(pin)(當然不可(ke)能(neng)100%相同)的(de)可(ke)比(bi)(bi)性(參見ICH Q5E指導(dao)性文件：Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process，生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)過程變化后(hou)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物工(gong)程/生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物產(chan)(chan)品(pin)的(de)可(ke)比(bi)(bi)性)。而(er)“相似(si)性”則是生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物類(lei)似(si)藥(yao)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)商仿制(zhi)的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物藥(yao)與原研藥(yao)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)商制(zhi)造的(de)參考品(pin)相比(bi)(bi)較而(er)言(yan)的(de)。

　　根據(ju)ICH的(de)定義，“可比(bi)性”概念是不可用于生物類似藥的(de)。但事實上，“可比(bi)性”和“?