檢驗方法驗證的(de)基本內(nei)容包(bao)括方案的(de)起草及審批，檢測儀(yi)器的(de)確認。

適用性驗證（包(bao)括準確度(du)(du)試(shi)驗、精(jing)密度(du)(du)測定、線(xian)性范圍(wei)試(shi)驗、專屬性試(shi)驗等）和結(jie)果評價及(ji)批(pi)準四個的(de)方(fang)面。

首先(xian)是制定(ding)驗證方(fang)案，然后對大(da)型(xing)精(jing)密儀器進行確(que)認，最(zui)關鍵的(de)一步是檢驗方(fang)法的(de)適用性試驗，最(zui)后是檢驗方(fang)法評價及批(pi)準。

1、驗證方案的制(zhi)定

檢驗方法的(de)(de)驗證方案(an)通常由質(zhi)量驗證小組提(ti)(ti)出(chu)。根據產(chan)品的(de)(de)工(gong)藝條件、原(yuan)輔料(liao)化學結(jie)構、中間(jian)體(ti)、分解產(chan)物查閱(yue)有關資料(liao)，提(ti)(ti)出(chu)規(gui)(gui)格標準(zhun)，確定檢查項目，規(gui)(gui)定雜質(zhi)限度，即為質(zhi)量標準(zhun)草案(an)。

根據質量標準(zhun)草(cao)案確(que)定檢查和試驗(yan)范圍，對檢驗(yan)方法擬(ni)定具體(ti)操作步驟，最后經(jing)有關(guan)人(ren)員審批(pi)方可(ke)實施。

2、大(da)型(xing)精(jing)密儀器(qi)的確認

分析(xi)測試中(zhong)所用的檢測儀器一般(ban)可分為三類：

A、普通儀器：崩解儀，折(zhe)光儀、分析天平(ping)、酸度計、溶點測定儀、電導儀等;

B、較精密儀(yi)器：旋光儀(yi)、永停滴定(ding)(ding)儀(yi)、費休氏水分(fen)測定(ding)(ding)儀(yi)、 自動滴定(ding)(ding)儀(yi)、藥物溶出度(du)儀(yi)、可見分(fen)光光度(du)計、電(dian)泳儀(yi)等；

C、大型精密(mi)儀(yi)(yi)器(qi)：紫外(wai)分光(guang)光(guang)度(du)計、紅外(wai)分光(guang)光(guang)度(du)計、氣相(xiang)色(se)譜(pu)儀(yi)(yi)、高(gao)效液相(xiang)色(se)譜(pu)儀(yi)(yi)、薄層掃描儀(yi)(yi)等。

為了保證分析(xi)測(ce)試數據準確(que)可靠，每臺檢(jian)測(ce)儀器(qi)在投入正式使用之前都應(ying)進行確(que)認。

檢測儀器的確認是檢驗方法(fa)驗證的基礎，應在其它(ta)驗證試驗開始之(zhi)前首(shou)先(xian)完(wan)成(cheng)。

檢測儀器確認(ren)(ren)工作內(nei)容應根據儀器類(lei)型。技術性能而定(ding)，通常包括：安裝確認(ren)(ren)、校正、適用性預(yu)試驗(yan)和再確認(ren)(ren)。

3、校正

校(xiao)正(zheng)是儀(yi)器確認(ren)及檢(jian)驗(yan)方法驗(yan)證中的(de)一個重要環節，應當(dang)在驗(yan)證試驗(yan)以前進行校(xiao)正(zheng)。紫(zi)外分光光度計(ji)校(xiao)正(zheng)包括波長(chang)校(xiao)正(zheng)、吸收度測試、準確度測試、雜散光檢(jian)查。

氣相(xiang)色譜儀與(yu)高效液相(xiang)色譜儀均要求做系(xi)統適用性試(shi)驗。在規定的色譜條(tiao)件(jian)下測(ce)定色譜柱的最(zui)小理(li)論塔板數。分離度和拖尾(wei)因子，并規定變異系(xi)數應(ying)不大于2％。

對于化學檢驗(yan)中使用的(de)計量儀器包括容量瓶(ping)、移液管(guan)、滴定(ding)管(guan)、分析天平亦均應校正。

4、適用性預試驗

儀(yi)器的(de)安裝(zhuang)確(que)認(ren)完(wan)成以后，在(zai)其(qi)功能(neng)試(shi)驗符(fu)合要求(qiu)的(de)情況下，應用標準品(pin)或(huo)對照品(pin)對其(qi)進(jin)行適用性檢查(cha)，以確(que)認(ren)儀(yi)器是否符(fu)合使用要求(qiu)。

例如對(dui)熔(rong)點測定儀(yi)的適用(yong)性預試驗是(shi)采用(yong)已(yi)(yi)知(zhi)溶點的甲硝唑做(zuo)試驗，測試結果與已(yi)(yi)知(zhi)熔(rong)點比(bi)較。

紫(zi)外(wai)分(fen)光光度計可用(yong)已知(zhi)含量的某標(biao)準品試驗，測得(de)結果與已知(zhi)數(shu)值對比，確定(ding)儀(yi)器是否符(fu)合使用(yong)要求。

在完(wan)成上述各項試驗工(gong)作的同時，應做好相應的文(wen)件記(ji)錄等資料歸檔工(gong)作，每一臺儀器均應有一套完(wan)整(zheng)的檔案資料。

5、再確認

為了確保儀器(qi)處于良好的(de)使用狀態(tai)，對于一臺新(xin)購買的(de)儀器(qi)在(zai)確認工作結束(shu)以后，應根據儀器(qi)的(de)類別(bie)。確認的(de)經驗制定再確認的(de)計劃(hua)。

再確認的時間間隔和(he)(he)內(nei)容要根據儀器類別和(he)(he)使用情況決(jue)定，一般是3個月(yue)、6個月(yue)或(huo)1年(nian)。

儀器再確(que)認的內容通常(chang)包括線路連接(jie)、附(fu)件備品消耗(hao)檢查(cha)、清潔工(gong)作、功(gong)能試(shi)驗(yan)(yan)、工(gong)作日記等，其(qi)中(zhong)重點(dian)安裝確(que)認中(zhong)的功(gong)能試(shi)驗(yan)(yan)。

藥品質(zhi)量(liang)標準分析方法驗證的目的是證明采用的方法適合于相應的檢測要求。

在(zai)起草(cao)藥品質量標(biao)準時，分析(xi)方(fang)法需(xu)經驗(yan)證(zheng)(zheng)：在(zai)藥物(wu)生產方(fang)法變更(geng)、制劑的組分變更(geng)、原分析(xi)方(fang)法進(jin)行修訂(ding)時，則質量標(biao)準分析(xi)方(fang)法也需(xu)進(jin)行驗(yan)證(zheng)(zheng)。

方法驗證(zheng)過程和結果均應記載(zai)在(zai)藥品(pin)標準起草或(huo)修訂(ding)說明中。

根據《中國藥典》附錄XIXA的原則要求，檢驗方法的驗證可分為三種情況處理；

1、無需驗證的方(fang)法(fa)。如藥(yao)典（包(bao)括(kuo)USP、EP、CP、JP等各國藥(yao)典)的方(fang)法(fa)，一般只做(zuo)系(xi)統適用性試驗，以確認系(xi)統是(shi)否符合(he)要(yao)(yao)求(主要(yao)(yao)指儀器穩定(ding)性及柱(zhu)的分離度是(shi)否達標）。

2、對(dui)比法(fa)(fa)(fa)(fa)。已(yi)在參比實驗室(shi)(shi)驗證(zheng)過的(de)分(fen)析方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)，可用對(dui)比試驗的(de)方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)來確認方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)的(de)可靠性(xing)，即將(jiang)本實驗室(shi)(shi)與參比實驗室(shi)(shi)用同一方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)對(dui)同批樣品所測數據進行(xing)比較(如至少(shao)取五個批號，每(mei)批重復測定五次)，判斷(duan)方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)在本實驗室(shi)(shi)的(de)可行(xing)性(xing)。

如有差異需查明(ming)原因(yin)或設計(ji)方(fang)案，對方(fang)法進(jin)行再(zai)驗(yan)證(zheng)。

3、需進行系統驗(yan)證(zheng)的方法。

安裝確認及適用性試驗(yan)結(jie)(jie)束后(hou)，應將試驗(yan)數據資料進行(xing)匯總分析。對檢驗(yan)方法作出正確的評價，驗(yan)證報告的說明(ming)及結(jie)(jie)論部分應簡明(ming)扼要。

試驗(yan)中的主要偏差應有適當解(jie)釋。然后(hou)，報(bao)主管(guan)領導審批。檢驗(yan)方法驗(yan)證的最終產物是一個經過驗(yan)證的方法—根據驗(yan)證的結(jie)果(guo)制(zhi)訂的由有關領導批準的檢驗(yan)方法。

在(zai)如(ru)何正確(que)或準(zhun)(zhun)確(que)地估(gu)算(suan)(suan)檢(jian)(jian)出限的(de)(de)(de)(de)問題上(shang),國際分(fen)析(xi)(xi)(xi)界一(yi)(yi)直存(cun)有爭(zheng)議(yi)。檢(jian)(jian)出限的(de)(de)(de)(de)特殊意義在(zai)于(yu)可以對一(yi)(yi)個(ge)給定(ding)的(de)(de)(de)(de)分(fen)析(xi)(xi)(xi)方法(fa)在(zai)低濃度水平的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測能力進行準(zhun)(zhun)確(que)地評估(gu)，而考察(cha)一(yi)(yi)個(ge)分(fen)析(xi)(xi)(xi)方法(fa)在(zai)低濃度范圍的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測性(xing)能，可以基于(yu)不同的(de)(de)(de)(de)角度或不同的(de)(de)(de)(de)側重(zhong)點,如(ru)可以從(cong)最(zui)小信號值與(yu)儀器噪音之(zhi)比來(lai)考察(cha)，從(cong)方法(fa)測定(ding)空白的(de)(de)(de)(de)平均波動性(xing)來(lai)統計估(gu)算(suan)(suan),也可以根據(ju)分(fen)析(xi)(xi)(xi)方法(fa)校準(zhun)(zhun)曲(qu)線(xian)的(de)(de)(de)(de)偏差特性(xing)來(lai)定(ding)量估(gu)算(suan)(suan)等等。

檢(jian)出限是(shi)評價(jia)一個分析(xi)方法及測試儀器性(xing)能(neng)的重要指(zhi)標,所謂“檢(jian)出”是(shi)指(zhi)定性(xing)檢(jian)出，即判(pan)定樣品中存在有濃度高于空白的待測物質。

ACS(美國化學學會)對這一定義作了更簡(jian)明的(de)概(gai)括:檢(jian)(jian)出限是一個分析方法(fa)能夠(gou)可(ke)靠地檢(jian)(jian)測出被分析物的(de)最低濃度。

1、檢測限（limit of detection, LOD）定義

在(zai)樣(yang)品中能檢(jian)出(chu)的(de)(de)(de)被測組分的(de)(de)(de)最低濃(nong)度(du)(du)(du)（量）稱為檢(jian)測限，即產生信號（峰(feng)高(gao)）為基線噪(zao)音標(biao)準(zhun)差k倍時的(de)(de)(de)樣(yang)品濃(nong)度(du)(du)(du)，一(yi)般(ban)為信噪(zao)比(bi)（S/N）2:1或(huo)3:1時的(de)(de)(de)濃(nong)度(du)(du)(du)，對其(qi)測定(ding)(ding)的(de)(de)(de)準(zhun)確(que)度(du)(du)(du)和精(jing)密度(du)(du)(du)沒有(you)確(que)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)要求。目前，一(yi)般(ban)將檢(jian)測限定(ding)(ding)義為信噪(zao)比(bi)（S/N）3:1時的(de)(de)(de)濃(nong)度(du)(du)(du)。

2、計算公式

D=3N/S （1）

式中(zhong)：N——噪音; S——檢測器靈敏(min)度；D——檢測限

而靈敏度的(de)計算公式為：

S=I/Q （2）

式中：S——靈敏度；I——信號響應(ying)值；Q——進樣量

將(jiang)式（1）和式（2）合并，得到下式：

D=3N×Q/I (3)

式中：Q——進(jin)樣量；N——噪(zao)音；I——信(xin)號響應值。I/N即為該(gai)進(jin)樣量下(xia)的(de)信(xin)噪(zao)比(bi)（S/N），該(gai)信(xin)噪(zao)比(bi)可通過工作站(zhan)(zhan)對圖譜(pu)進(jin)行(xing)自動分析(xi)(xi)獲得，一般的(de)色譜(pu)或質譜(pu)工作站(zhan)(zhan)都可進(jin)行(xing)信(xin)噪(zao)比(bi)分析(xi)(xi)計算(suan)。這(zhe)樣檢測限的(de)計算(suan)方法(fa)就變得非常(chang)方便了(le)。

3、計算(suan)方法

實際(ji)計算時，檢出(chu)限有2種(zhong)表示方法(fa)：一種(zhong)是(shi)進樣(yang)瓶(ping)中樣(yang)品檢測(ce)限，一種(zhong)是(shi)針對原始樣(yang)品的方法(fa)檢出(chu)限。

A、對第一種檢測(ce)限(xian)(xian)，只要知道進(jin)(jin)樣(yang)(yang)(yang)量和信(xin)噪比即(ji)可計算。如進(jin)(jin)樣(yang)(yang)(yang)瓶(ping)中樣(yang)(yang)(yang)品(pin)濃度為(wei)1 mg/L,在此濃度下的信(xin)噪比為(wei)300(由工作站分(fen)析獲得)，則其檢測(ce)限(xian)(xian)為(wei)：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也(ye)可用絕對進(jin)(jin)樣(yang)(yang)(yang)量表示，若進(jin)(jin)樣(yang)(yang)(yang)體積為(wei)10 ul，則其檢測(ce)限(xian)(xian)為(wei)：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。

B、對第二種表示(shi)方(fang)法(fa)(fa)，需同時考慮原(yuan)始樣(yang)(yang)(yang)品的(de)取樣(yang)(yang)(yang)量(liang)和提取樣(yang)(yang)(yang)品的(de)定容體積(ji)。仍按前述樣(yang)(yang)(yang)品計算，若取樣(yang)(yang)(yang)量(liang)為(wei)(wei)5克(ke)，最后定容體積(ji)為(wei)(wei)5 mL，則方(fang)法(fa)(fa)檢測(ce)限為(wei)(wei)：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

即(ji)當(dang)原始樣(yang)品(pin)中(zhong)待檢(jian)物質的(de)(de)(de)濃(nong)度(du)為(wei)0.01mg/kg時(shi)，若取樣(yang)量為(wei)5g,樣(yang)品(pin)經前(qian)處理后定容體積(ji)為(wei)5mL時(shi),進(jin)樣(yang)瓶中(zhong)樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)濃(nong)度(du)可達0.01mg/L（假(jia)定回(hui)收(shou)率為(wei)100%）,此(ci)時(shi)，在其(qi)它(ta)給定的(de)(de)(de)分析條件下，能產(chan)生3倍噪聲(sheng)強度(du)的(de)(de)(de)信號。在實際檢(jian)測工作(zuo)中(zhong)，第二(er)種表(biao)示方法更為(wei)常見。

4、注意事項

由(you)式(shi)（3）可(ke)見，信噪(zao)(zao)比的(de)(de)大小直接關系到檢測(ce)限的(de)(de)大小。信噪(zao)(zao)比計算方法的(de)(de)不同，其(qi)比值(zhi)大小有(you)很(hen)大不同，這與計算信噪(zao)(zao)比時基(ji)線噪(zao)(zao)聲峰值(zhi)的(de)(de)定義方式(shi)有(you)關，一般有(you)三種不同的(de)(de)定義：

A、峰/峰（peak to peak）信(xin)噪(zao)比，用某(mou)一段基線噪(zao)聲的平均高(gao)度(du)；

B、峰(feng)/半峰(feng)（half peak to peak）信噪比, 用某一段基線噪聲平均高度(du)的1/2；

C、均方根(gen)（RMS）信噪(zao)(zao)比(bi)，用(yong)某一段基線(xian)噪(zao)(zao)聲的均方根(gen)值(zhi)計算(suan)。

除此之(zhi)外，信噪(zao)比(bi)的計(ji)算結果還(huan)和(he)所取(qu)(qu)(qu)噪(zao)聲的位置有很大(da)關系，取(qu)(qu)(qu)信號(hao)哪(na)一(yi)側基線的噪(zao)聲，取(qu)(qu)(qu)多(duo)長一(yi)段基線上(shang)的噪(zao)聲，計(ji)算結果都很不(bu)完全(quan)相(xiang)同，有時相(xiang)差甚遠(yuan)。一(yi)般多(duo)取(qu)(qu)(qu)樣品峰兩側的噪(zao)聲峰值計(ji)算。

5、檢出限(xian)的確定

A、《全球(qiu)環境監測(ce)系統水(shui)(shui)監測(ce)操作指南》中規(gui)定(ding)：給定(ding)置信(xin)水(shui)(shui)平為95%時(shi)，樣品測(ce)定(ding)值(zhi)(zhi)與零濃度樣品的測(ce)定(ding)值(zhi)(zhi)有(you)顯著性差異即為檢出(chu)限：

L = 4.6Sb

式中：L——方法的最(zui)低檢出(chu)濃度(du)。

Sb ——測(ce)定次(ci)數為n次(ci)的空白平(ping)行測(ce)定（批內）標準(zhun)差（重復測(ce)定20次(ci)以上）。

B、國際純粹(cui)和應用化學(xue)聯(lian)合會（IUPAC）規定對各種光(guang)學(xue)分析方(fang)法，可(ke)用下式計算：

L = KSb/S

L——方法的最低檢出濃(nong)度

Sb——空白(bai)多次測(ce)量的標準偏差（吸光(guang)度）；

S ——方法(fa)的靈敏度（即校準曲(qu)線的斜率）

為(wei)了(le)評估 ，空白(bai)測定(ding)次(ci)數(shu)必須足夠多，最(zui)好(hao)能測20次(ci)。國際純粹和(he)應用化學聯合(he)會極(ji)力提倡取(qu)k值(zhi)為(wei)3，一般來說，取(qu) 相應的置(zhi)信(xin)水平大約(yue)為(wei)90%。

若 =0，并不意(yi)味著(zhu) ，或檢出限(xian)無限(xian)小。這(zhe)時需配制一(yi)個(ge)濃度(du)略大(da)于零濃度(du)的試樣(yang)系(xi)列（能產(chan)生一(yi)個(ge)可測信號值(zhi)）代替全程序空白試驗，求出其標(biao)準(zhun)偏差，用來代替 。

此外，有時為(wei)(wei)(wei)了工作(zuo)方便(bian)和便(bian)于比較，也規定(ding)一(yi)個大家能接受的信號(hao)值作(zuo)為(wei)(wei)(wei)檢(jian)出(chu)限，如分光(guang)光(guang)度法中(zhong)，規定(ding)吸光(guang)度為(wei)(wei)(wei)0.010所(suo)對(dui)應(ying)的濃度即為(wei)(wei)(wei)檢(jian)出(chu)限L。

C、 美國(guo)EPA SW—846規定方法中的(de)檢出限為(wei)：

L=3.143Sb

D、某些(xie)分光(guang)光(guang)度法是以吸(xi)光(guang)度（扣除(chu)空白）為0.010相對應的濃度值或絕對量(liang)為檢出限(xian)，這是一種實(shi)驗室間的協定方(fang)案。

E、氣相色譜(pu)(pu)法：檢(jian)測器恰能(neng)產(chan)生與(yu)噪(zao)音相區(qu)別的響應信號時(shi)所需進入色譜(pu)(pu)的物質最(zui)小量為檢(jian)出限，一(yi)般為噪(zao)音的二倍(bei)。

F、離(li)子(zi)選(xuan)擇(ze)電(dian)極(ji)(ji)法：當(dang)校準曲線的(de)直(zhi)線部分(fen)外(wai)延的(de)延長(chang)線與通過(guo)空(kong)白電(dian)位且平行(xing)于濃(nong)度(du)軸的(de)直(zhi)線相交(jiao)時，其交(jiao)點所(suo)對(dui)應的(de)濃(nong)度(du)值即為(wei)該離(li)子(zi)色譜所(suo)對(dui)電(dian)極(ji)(ji)法的(de)檢出限。

由測得的空(kong)白值(zhi)(zhi)計算出(chu)(chu)的L值(zhi)(zhi)不應大于分(fen)析方法規定(ding)(ding)的最低檢出(chu)(chu)濃度值(zhi)(zhi)，如(ru)大于方法規定(ding)(ding)值(zhi)(zhi)時，必須(xu)尋找原因(yin)降低空(kong)白值(zhi)(zhi)，重新測定(ding)(ding)計算至(zhi)合格。

6、校(xiao)正曲(qu)線繪(hui)制

A、按(an)分析(xi)方法(fa)步驟，通過實測(ce)濃度和儀器信(xin)號值(zhi)的(de)(de)(de)直線關系，確定實驗室條件(jian)下的(de)(de)(de)測(ce)定上(shang)限。當測(ce)定上(shang)限低于方法(fa)的(de)(de)(de)檢測(ce)上(shang)限時，只能用實測(ce)的(de)(de)(de)直線范(fan)圍。

B、繪制校正曲線的(de)分(fen)析(xi)步驟應與(yu)樣品分(fen)析(xi)相(xiang)同，并且不少于5個濃(nong)度值。

C、校正(zheng)曲(qu)線(xian)繪制與每批測定樣(yang)品同時進行，對(dui)某些分析方法(fa)的(de)校正(zheng)曲(qu)線(xian)的(de)斜率(lv)穩定，批間(jian)誤差較小，使(shi)用原制校正(zheng)曲(qu)線(xian)時，應與樣(yang)品同時測定2份(fen)中(zhong)等濃度標(biao)樣(yang)和2份(fen)空(kong)白的(de)平行樣(yang)。

測得標準的濃(nong)度（減去空白）值(zhi)與原(yuan)校正(zheng)曲線相對(dui)應的濃(nong)度值(zhi)的相對(dui)偏差(cha)，分(fen)光光度應小于5%；原(yuan)子(zi)吸收法應小于10%，否則重新制作校正(zheng)曲線。

最后還要特(te)別強調，檢出限和測定下限是(shi)兩個(ge)(ge)不同(tong)的(de)概(gai)念，它(ta)們(men)是(shi)評價一個(ge)(ge)分(fen)析方法(fa)及測試儀(yi)器(qi)性(xing)能的(de)重(zhong)要指標(biao)，檢出限是(shi)一個(ge)(ge)定性(xing)概(gai)念，而測定下(xia)限是(shi)一個(ge)(ge)定量概(gai)念，搞清(qing)楚兩者概(gai)念和相互關系，可提高色譜分(fen)析中檢測結果的(de)準確性(xing)和可靠性(xing)，特別在(zai)痕量分(fen)析中，檢出限和測定下(xia)限的(de)確定對于分(fen)析方法(fa)的(de)選擇具有重(zhong)要意(yi)(yi)義，同(tong)樣的(de)，對于實驗室質量控制也具有很(hen)重(zhong)要的(de)意(yi)(yi)義。

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