01檢驗方(fang)法(fa)驗證的(de)基(ji)本內容(rong)

　　檢驗方(fang)法驗證的(de)基本(ben)內(nei)容包括方(fang)案的(de)起草(cao)及審批，檢測儀(yi)器(qi)的(de)確認。

　　適用(yong)性驗(yan)(yan)證(包括(kuo)準確度試驗(yan)(yan)、精密度測定、線性范圍試驗(yan)(yan)、專屬性試驗(yan)(yan)等(deng))和結果評(ping)價及(ji)批(pi)準四(si)個的方(fang)面。

　　02檢驗(yan)(yan)方法驗(yan)(yan)證(zheng)的基本步驟

　　首先(xian)是制定(ding)驗證(zheng)方案(an)，然后對大型精密(mi)儀器進行確認，最關(guan)鍵的(de)一步是檢驗方法的(de)適用性(xing)試驗，最后是檢驗方法評價及批準。

　　1、驗證方案的制定

　　檢(jian)驗方(fang)法的驗證方(fang)案通常由質量驗證小(xiao)組提出(chu)(chu)。根(gen)據產品的工藝(yi)條(tiao)件、原輔料化學(xue)結構(gou)、中間體、分(fen)解產物查閱有(you)關資料，提出(chu)(chu)規格(ge)標準，確定檢(jian)查項(xiang)目，規定雜質限度(du)，即為質量標準草(cao)案。

　　根據質量標準草(cao)案確(que)定檢查和(he)試(shi)驗(yan)范(fan)圍，對檢驗(yan)方法擬定具體操作步驟，最后(hou)經有關(guan)人員審批方可實施。

　　2、大型精密儀器的確認

　　分析(xi)測試中所(suo)用的檢測儀器(qi)一般可分為三(san)類(lei)：

　　A、普通儀(yi)器(qi)：崩解儀(yi)，折光儀(yi)、分析天(tian)平、酸度計、溶(rong)點測(ce)定(ding)儀(yi)、電導儀(yi)等;

　　B、較(jiao)精密儀(yi)器(qi)：旋光(guang)儀(yi)、永停(ting)滴定儀(yi)、費休氏水分測定儀(yi)、 自動滴定儀(yi)、藥物溶出度儀(yi)、可見分光(guang)光(guang)度計、電泳儀(yi)等;

　　C、大(da)型精密儀(yi)(yi)器：紫外分光光度計、紅外分光光度計、氣相色(se)譜(pu)儀(yi)(yi)、高效液相色(se)譜(pu)儀(yi)(yi)、薄層掃(sao)描儀(yi)(yi)等。

　　為了(le)保(bao)證分析測(ce)試數據(ju)準(zhun)確(que)可靠，每臺(tai)檢測(ce)儀器在投入正式使(shi)用之(zhi)前都應進行確(que)認。

　　檢測儀器(qi)的(de)確(que)認是檢驗方法驗證的(de)基礎，應在其它(ta)驗證試驗開始之(zhi)前首先完成。

　　檢測儀器(qi)(qi)確認工作(zuo)內容(rong)應根(gen)據儀器(qi)(qi)類型。技術性(xing)能而定，通(tong)常包括：安裝(zhuang)確認、校(xiao)正、適用性(xing)預試驗和再確認。

　　3、校正

　　校(xiao)(xiao)正(zheng)是(shi)儀器確(que)認(ren)及檢驗方法(fa)驗證中的一個重要環節，應當在驗證試(shi)驗以前進行校(xiao)(xiao)正(zheng)。紫外分(fen)光光度(du)計校(xiao)(xiao)正(zheng)包括(kuo)波長(chang)校(xiao)(xiao)正(zheng)、吸收度(du)測試(shi)、準確(que)度(du)測試(shi)、雜散光檢查。

　　氣(qi)相(xiang)色(se)譜(pu)儀與高(gao)效液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)儀均要求(qiu)做系(xi)統(tong)適用(yong)性試(shi)驗。在(zai)規定的色(se)譜(pu)條件下測定色(se)譜(pu)柱的最小(xiao)理論塔板數。分離度和拖尾(wei)因(yin)子，并(bing)規定變異(yi)系(xi)數應不大于2%。

　　對于(yu)化(hua)學檢驗(yan)中使用(yong)的計量儀(yi)器包括容量瓶(ping)、移液管、滴定(ding)管、分析天平(ping)亦均(jun)應校(xiao)正。

　　4、適用性預試驗

　　儀器的(de)(de)安裝確認完成以后，在其功能試驗(yan)符(fu)合(he)(he)要(yao)求的(de)(de)情況(kuang)下，應(ying)用標準(zhun)品(pin)或對(dui)(dui)照品(pin)對(dui)(dui)其進行適用性(xing)檢查，以確認儀器是(shi)否(fou)符(fu)合(he)(he)使(shi)用要(yao)求。

　　例(li)如對(dui)熔點(dian)測定儀的(de)適用性(xing)預試(shi)驗(yan)是(shi)采用已(yi)知溶點(dian)的(de)甲硝唑做(zuo)試(shi)驗(yan)，測試(shi)結果與(yu)已(yi)知熔點(dian)比較。

　　紫外分光光度(du)計可用已知含量(liang)的某標準(zhun)品試(shi)驗，測得結果與已知數值對比(bi)，確定儀器(qi)是否符合使用要(yao)求。

　　在完成上(shang)述各項試驗工作的(de)同時，應做好(hao)相應的(de)文件記(ji)錄等資料歸檔工作，每一臺儀器均應有一套完整的(de)檔案資料。

　　5、再確認

　　為(wei)了(le)確(que)(que)保儀器(qi)處(chu)于良(liang)好(hao)的使用狀態，對于一臺新購(gou)買的儀器(qi)在確(que)(que)認工作結束(shu)以后，應根據儀器(qi)的類(lei)別(bie)。確(que)(que)認的經驗制定再確(que)(que)認的計(ji)劃。

　　再確認的(de)時間(jian)間(jian)隔和內容(rong)要根據儀器類(lei)別和使用情(qing)況(kuang)決定，一(yi)般是3個月、6個月或1年。

　　儀器再確認的內容通(tong)常包括線路(lu)連接、附件備品消耗(hao)檢查(cha)、清潔工作(zuo)、功能(neng)試驗、工作(zuo)日(ri)記等，其中重點安裝確認中的功能(neng)試驗。

　　03檢驗(yan)方法(fa)的適用性(xing)驗(yan)證

　　藥品質(zhi)量標準分析方法驗(yan)證的(de)目(mu)的(de)是證明(ming)采用的(de)方法適合于相應的(de)檢(jian)測(ce)要求。

　　在(zai)起草藥(yao)品(pin)質量(liang)標準時(shi)，分(fen)析方(fang)法(fa)(fa)需(xu)經驗證(zheng)：在(zai)藥(yao)物生(sheng)產(chan)方(fang)法(fa)(fa)變更、制(zhi)劑的組(zu)分(fen)變更、原分(fen)析方(fang)法(fa)(fa)進(jin)(jin)行修訂時(shi)，則質量(liang)標準分(fen)析方(fang)法(fa)(fa)也需(xu)進(jin)(jin)行驗證(zheng)。

　　方法驗(yan)證過程和結果(guo)均(jun)應記載在藥(yao)品標準(zhun)起草(cao)或修(xiu)訂說明中。

　　根(gen)據《中國藥典》 (2010版)附錄XIXA的原則要求(qiu)，檢驗方法的驗證可分為三種情(qing)況處理;

　　1、無(wu)需驗證的(de)(de)方(fang)(fang)法。如藥典(包(bao)括USP、EP、CP、JP等(deng)各國藥典)的(de)(de)方(fang)(fang)法，一般只做系統(tong)(tong)適用性試驗，以確認系統(tong)(tong)是(shi)否(fou)符合要求(主要指儀(yi)器(qi)穩(wen)定(ding)性及柱的(de)(de)分離度是(shi)否(fou)達(da)標)。

　　2、對比法(fa)(fa)(fa)。已(yi)在(zai)參比實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)(shi)驗(yan)(yan)證過的分(fen)析(xi)方(fang)法(fa)(fa)(fa)，可用(yong)對比試驗(yan)(yan)的方(fang)法(fa)(fa)(fa)來確(que)認方(fang)法(fa)(fa)(fa)的可靠性，即將本(ben)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)(shi)與參比實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)(shi)用(yong)同(tong)一方(fang)法(fa)(fa)(fa)對同(tong)批樣品所測(ce)(ce)數據進(jin)行比較(如至少取五個批號，每批重復(fu)測(ce)(ce)定五次(ci))，判斷方(fang)法(fa)(fa)(fa)在(zai)本(ben)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)(shi)的可行性。如有差異需查明原(yuan)因或設計方(fang)案(an)，對方(fang)法(fa)(fa)(fa)進(jin)行再驗(yan)(yan)證。

　　3、需進行系統驗證的方法。

　　04檢驗方法的評(ping)價及批準

　　安裝確認(ren)及適用性試驗(yan)結束(shu)后，應(ying)將試驗(yan)數(shu)據(ju)資(zi)料進行匯總分析。對(dui)檢驗(yan)方法作出正確的(de)評價，驗(yan)證報(bao)告的(de)說明(ming)及結論部(bu)分應(ying)簡明(ming)扼(e)要(yao)。

　　試驗(yan)(yan)中的主要偏差應有適當(dang)解釋。然(ran)后，報主管領導(dao)審批(pi)(pi)。檢驗(yan)(yan)方法驗(yan)(yan)證(zheng)的最終產(chan)物是一個(ge)經過驗(yan)(yan)證(zheng)的方法—根據驗(yan)(yan)證(zheng)的結果(guo)制訂的由有關(guan)領導(dao)批(pi)(pi)準的檢驗(yan)(yan)方法。

　　05如(ru)何詳(xiang)細計算檢(jian)出限

　　在(zai)(zai)如何正確或準(zhun)確地(di)估算(suan)(suan)檢(jian)(jian)出(chu)限的(de)(de)問題上,國際分(fen)析界一直存有爭議。檢(jian)(jian)出(chu)限的(de)(de)特殊意義在(zai)(zai)于可以(yi)對一個(ge)給定(ding)的(de)(de)分(fen)析方(fang)法(fa)在(zai)(zai)低(di)濃度(du)(du)水平的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)能(neng)(neng)力(li)進(jin)行準(zhun)確地(di)評估，而考察一個(ge)分(fen)析方(fang)法(fa)在(zai)(zai)低(di)濃度(du)(du)范圍的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)性(xing)(xing)能(neng)(neng)，可以(yi)基于不(bu)同的(de)(de)角(jiao)度(du)(du)或不(bu)同的(de)(de)側重(zhong)點,如可以(yi)從最小信號值與儀器噪音(yin)之比來考察，從方(fang)法(fa)測(ce)定(ding)空白的(de)(de)平均波(bo)動(dong)性(xing)(xing)來統計估算(suan)(suan),也可以(yi)根據分(fen)析方(fang)法(fa)校準(zhun)曲線的(de)(de)偏差特性(xing)(xing)來定(ding)量(liang)估算(suan)(suan)等等。

　　檢(jian)(jian)出(chu)(chu)(chu)限是評價一個(ge)分析方法(fa)及測(ce)試(shi)儀器(qi)性能的(de)重要指標,所謂“檢(jian)(jian)出(chu)(chu)(chu)”是指定性檢(jian)(jian)出(chu)(chu)(chu)，即判定樣品(pin)中存在(zai)有(you)濃度高于空白的(de)待測(ce)物(wu)質。

　　ACS(美國化(hua)學學會)對這一定義作了更簡明的概括:檢(jian)出(chu)限是(shi)一個分析方(fang)法能夠可靠地檢(jian)測出(chu)被分析物的最低濃度。

　　1、檢測限(limit of detection, LOD)定義(yi):

　　在(zai)樣(yang)品中能(neng)檢(jian)(jian)出的被測組分的最低濃度(du)(量)稱為(wei)檢(jian)(jian)測限(xian)，即產生(sheng)信(xin)號(峰高)為(wei)基線(xian)噪(zao)音標準(zhun)差k倍時(shi)(shi)的樣(yang)品濃度(du)，一般為(wei)信(xin)噪(zao)比(S/N)2:1或3:1時(shi)(shi)的濃度(du)，對其測定的準(zhun)確(que)度(du)和精密度(du)沒有確(que)定的要(yao)求(qiu)。目前(qian)，一般將檢(jian)(jian)測限(xian)定義為(wei)信(xin)噪(zao)比(S/N)3:1時(shi)(shi)的濃度(du)。

　　2、計(ji)算(suan)公式為(wei)：

　　D=3N/S (1)

　　式中(zhong)：N——噪音; S——檢測器靈敏度;D——檢測限

　　將式(shi)(1)和式(shi)(2)合并，得到下(xia)式(shi)：D=3N×Q/I (3)

　　式中(zhong)：Q——進(jin)(jin)樣量;N——噪音;I——信(xin)號響應值。I/N即為該進(jin)(jin)樣量下的信(xin)噪比(bi)(S/N)，該信(xin)噪比(bi)可通(tong)過工(gong)作(zuo)站對圖譜進(jin)(jin)行自動分析獲得，一般(ban)的色譜或(huo)質譜工(gong)作(zuo)站都可進(jin)(jin)行信(xin)噪比(bi)分析計算。這樣檢測限(xian)的計算方法就變得非常方便了。

　　3、計算方法：

　　實際計算時(shi)，檢(jian)出限有2種表示方法：一種是進樣(yang)(yang)瓶中樣(yang)(yang)品(pin)檢(jian)測(ce)限，一種是針對原始樣(yang)(yang)品(pin)的方法檢(jian)出限。

　　A、對(dui)第一種檢測限(xian)(xian)，只要知道(dao)進樣量和信噪(zao)比即可(ke)計算。如進樣瓶中(zhong)樣品濃(nong)(nong)度為1 mg/L,在此濃(nong)(nong)度下(xia)的信噪(zao)比為300(由(you)工作(zuo)站分析(xi)獲得)，則其(qi)檢測限(xian)(xian)為：D =(3×1 mg L-1)/300 = 0.01 mg/L。也可(ke)用(yong)絕(jue)對(dui)進樣量表示，若(ruo)進樣體積為10 uL，則其(qi)檢測限(xian)(xian)為：D = 3×(1 mgL-1×10 ul)/300 = 0.1 ng。

　　B、對第二(er)種(zhong)表示方(fang)法，需同時考慮原始樣品的(de)取(qu)樣量和提取(qu)樣品的(de)定容體(ti)積。仍按(an)前述樣品計算，若取(qu)樣量為5克，最(zui)后定容體(ti)積為5 mL，則方(fang)法檢測限為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

　　即當原(yuan)始樣(yang)(yang)品(pin)中待檢(jian)(jian)物質的(de)濃度為(wei)0.01mg/kg時(shi)，若取樣(yang)(yang)量為(wei)5g,樣(yang)(yang)品(pin)經前處(chu)理(li)后(hou)定(ding)容(rong)體積為(wei)5mL時(shi),進樣(yang)(yang)瓶中樣(yang)(yang)品(pin)的(de)濃度可(ke)達0.01mg/L(假定(ding)回收率為(wei)100%),此時(shi)，在(zai)(zai)其它(ta)給(gei)定(ding)的(de)分析條件下，能產生3倍噪(zao)聲強度的(de)信號(hao)。在(zai)(zai)實際檢(jian)(jian)測工作(zuo)中，第(di)二(er)種表示方(fang)法更為(wei)常見(jian)。

　　4、注意事項

　　由(you)式(3)可見(jian)，信噪比的(de)(de)大(da)小直(zhi)接關系到(dao)檢測限的(de)(de)大(da)小。信噪比計(ji)算方(fang)法的(de)(de)不同，其比值大(da)小有很大(da)不同，這與(yu)計(ji)算信噪比時基(ji)線噪聲峰值的(de)(de)定義(yi)方(fang)式有關，一般有三種不同的(de)(de)定義(yi)：

　　A、峰(feng)/峰(feng)(peak to peak)信噪比，用某(mou)一段基線噪聲的平均高度;

　　B、峰/半峰(half peak to peak)信噪(zao)比, 用(yong)某一段基線噪(zao)聲平均(jun)高度的1/2;

　　C、均(jun)方(fang)根(gen)(RMS)信噪比，用某一段基(ji)線噪聲的(de)均(jun)方(fang)根(gen)值計算。

　　除(chu)此之外(wai)，信(xin)噪(zao)比的(de)(de)(de)計(ji)算(suan)結果還和(he)所(suo)取(qu)噪(zao)聲(sheng)的(de)(de)(de)位置(zhi)有(you)很大關(guan)系(xi)，取(qu)信(xin)號哪一(yi)側基(ji)線的(de)(de)(de)噪(zao)聲(sheng)，取(qu)多長一(yi)段(duan)基(ji)線上的(de)(de)(de)噪(zao)聲(sheng)，計(ji)算(suan)結果都很不完(wan)全相同，有(you)時(shi)相差(cha)甚遠。一(yi)般多取(qu)樣品峰兩(liang)側的(de)(de)(de)噪(zao)聲(sheng)峰值計(ji)算(suan)。

　　5、檢出限的確定

　　A、《全球環境監(jian)測(ce)系統(tong)水監(jian)測(ce)操(cao)作指(zhi)南》中規定(ding)：給定(ding)置信(xin)水平(ping)為95%時(shi)，樣品測(ce)定(ding)值(zhi)與零濃度樣品的測(ce)定(ding)值(zhi)有顯著(zhu)性差(cha)異(yi)即為檢(jian)出限：

　　L = 4.6Sb式中：

　　L——方法的最低檢(jian)出(chu)濃度。

　　Sb ——測(ce)定次(ci)數(shu)為n次(ci)的空(kong)白(bai)平行測(ce)定(批內(nei))標準(zhun)差(重復測(ce)定20次(ci)以上)。

　　B、國(guo)際(ji)純粹和應用化學聯合會(IUPAC)規定對各種光學分析方法(fa)，可用下式計算：

　　L = KSb/S

　　L——方(fang)法的(de)最低檢出濃度

　　Sb——空(kong)白多次測量的標準偏(pian)差(吸光度);

　　S ——方(fang)法的靈敏度(即校準曲(qu)線(xian)的斜(xie)率)

　　為(wei)了(le)評估 ，空白(bai)測定次數必須足夠多，最好能測20次。國際純(chun)粹和(he)應(ying)用(yong)化學聯合會極力提倡取k值為(wei)3，一般來說，取 相應(ying)的置信水平(ping)大約為(wei)90%。

　　若 =0，并不意味著(zhu) ，或檢出限無(wu)限小。這時需配制一個濃度(du)(du)略大于零濃度(du)(du)的(de)試(shi)樣系列(能(neng)產生一個可測信號(hao)值)代(dai)替(ti)全程序空白試(shi)驗，求出其標(biao)準偏差，用來代(dai)替(ti) 。

　　此外(wai)，有時為(wei)了工作(zuo)方便和便于比較，也規定一個大家能(neng)接受的信號值作(zuo)為(wei)檢(jian)出限，如分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法中(zhong)，規定吸光(guang)度(du)為(wei)0.010所對應的濃度(du)即為(wei)檢(jian)出限L。

　　C、 美(mei)國EPA SW—846規定(ding)方法中的檢出限為：

　　L=3.143Sb

　　D、某(mou)些分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)法是(shi)以吸光(guang)(guang)度(du)(扣除空白(bai))為0.010相對(dui)應(ying)的(de)濃度(du)值或絕(jue)對(dui)量為檢出(chu)限，這是(shi)一種實驗室間的(de)協(xie)定方案。

　　E、氣相(xiang)色(se)譜法：檢(jian)測(ce)器恰能產生(sheng)與噪音相(xiang)區別(bie)的響應信(xin)號時所需進入色(se)譜的物質最小量為檢(jian)出限(xian)，一(yi)般為噪音的二倍。

　　F、離(li)子選擇電極法：當校(xiao)準曲線的(de)直線部分(fen)外延的(de)延長線與通過空白電位且平行(xing)于濃度軸的(de)直線相交(jiao)時，其交(jiao)點所(suo)對應的(de)濃度值(zhi)即為(wei)該離(li)子色譜所(suo)對電極法的(de)檢出限。

　　由測得的空(kong)白(bai)值計算(suan)出的L值不應(ying)大(da)(da)于(yu)分析(xi)方(fang)法規(gui)定的最低檢(jian)出濃度值，如大(da)(da)于(yu)方(fang)法規(gui)定值時(shi)，必須尋找原因降低空(kong)白(bai)值，重新測定計算(suan)至合格(ge)。

　　6、校正曲線繪(hui)制：

　　A、按分析方法步(bu)驟，通過實測(ce)濃度和(he)儀器信號值的直線關系(xi)，確(que)定(ding)實驗室條件下的測(ce)定(ding)上(shang)限(xian)。當(dang)測(ce)定(ding)上(shang)限(xian)低于方法的檢(jian)測(ce)上(shang)限(xian)時，只能用實測(ce)的直線范圍。

　　B、繪制校正曲線的分(fen)析步驟應與樣品(pin)分(fen)析相同(tong)，并且(qie)不少于5個濃度值。

　　C、校(xiao)正(zheng)曲線(xian)繪制與每批測(ce)定(ding)樣(yang)品(pin)同時(shi)進(jin)行(xing)，對(dui)某(mou)些分析方法的(de)(de)校(xiao)正(zheng)曲線(xian)的(de)(de)斜率穩定(ding)，批間誤差較小，使用原制校(xiao)正(zheng)曲線(xian)時(shi)，應(ying)與樣(yang)品(pin)同時(shi)測(ce)定(ding)2份中等濃度標樣(yang)和2份空白的(de)(de)平行(xing)樣(yang)。

　　測(ce)得(de)標準的(de)濃(nong)度(du)(減(jian)去空白(bai))值與原校正曲線(xian)相(xiang)對應的(de)濃(nong)度(du)值的(de)相(xiang)對偏差，分光光度(du)應小于5%;原子吸收(shou)法(fa)應小于10%，否則重新制作校正曲線(xian)。

　　06小(xiao)結

　　最后還(huan)要特別強調，檢出限(xian)和測(ce)(ce)定(ding)(ding)下限(xian)是兩(liang)個(ge)不同的(de)(de)(de)概(gai)(gai)念，它們(men)是評價一(yi)個(ge)分(fen)析(xi)方(fang)(fang)法(fa)及測(ce)(ce)試儀器性(xing)能的(de)(de)(de)重要指(zhi)標，檢出限(xian)是一(yi)個(ge)定(ding)(ding)性(xing)概(gai)(gai)念，而測(ce)(ce)定(ding)(ding)下限(xian)是一(yi)個(ge)定(ding)(ding)量概(gai)(gai)念，搞(gao)清楚兩(liang)者概(gai)(gai)念和相互關系(xi)，可(ke)提高色譜分(fen)析(xi)中(zhong)檢測(ce)(ce)結果的(de)(de)(de)準(zhun)確性(xing)和可(ke)靠(kao)性(xing)，特別在痕(hen)量分(fen)析(xi)中(zhong)，檢出限(xian)和測(ce)(ce)定(ding)(ding)下限(xian)的(de)(de)(de)確定(ding)(ding)對(dui)于(yu)分(fen)析(xi)方(fang)(fang)法(fa)的(de)(de)(de)選擇(ze)具有重要意義，同樣的(de)(de)(de)，對(dui)于(yu)實驗室質量控(kong)制也具有很重要的(de)(de)(de)意義。