污染(ran)是(shi)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養的(de)大(da)敵。預防(fang)和避免污染(ran)是(shi)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養成功(gong)的(de)關鍵之一。一開始就要十分重視(shi)，防(fang)止污染(ran)，否(fou)則會前功(gong)盡(jin)棄，不僅浪費(fei)時間，而且浪費(fei)人力、物(wu)力，甚至(zhi)造成無法彌(mi)補的(de)損失。

　　(一)污染的類型

　　細胞(bao)培(pei)養(yang)過(guo)程中的(de)污染不僅僅指微生物，而(er)且還包(bao)括所有(you)混(hun)入培(pei)養(yang)環境中的(de)、對(dui)細胞(bao)生存有(you)害或造成細胞(bao)不純的(de)物質(zhi)，包(bao)括生物和化學物質(zhi)。

　　1、細(xi)菌污染

　　細(xi)菌(jun)污(wu)染(ran)是(shi)實驗室細(xi)胞培(pei)(pei)養中(zhong)常見的污(wu)染(ran)，即使在細(xi)胞培(pei)(pei)養液中(zhong)加入了(le)抗菌(jun)素，也可能因為操作(zuo)不慎而引起污(wu)染(ran)。最常見的有革蘭(lan)氏陽性菌(jun)，如枯草桿菌(jun)以及大腸桿菌(jun)、假單胞菌(jun)等革蘭(lan)氏陰性菌(jun)，其中(zhong)又以白色葡(pu)萄(tao)球菌(jun)較常見。

　　培養細胞(bao)(bao)受(shou)細菌污(wu)染(ran)后，會出現培養液變混濁(zhuo)，pH改(gai)變。污(wu)染(ran)后細胞(bao)(bao)發生病(bing)理改(gai)變，胞(bao)(bao)內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落(luo)死亡(wang)。

　　2、真菌(jun)污染

　　真(zhen)菌污染是細胞培養(yang)過程中最(zui)常見的(de)一(yi)種，最(zui)常見的(de)真(zhen)菌有煙曲霉(mei)、黑曲菌、孔子霉(mei)、毛霉(mei)菌、白色念珠菌和酵(jiao)母菌。

　　培養(yang)(yang)細胞受真菌(jun)污(wu)染后(hou)，可見(jian)培養(yang)(yang)液中漂浮(fu)著白色或淺黃色的小點，有(you)的散在生長，培養(yang)(yang)液一般不發生混濁;倒置顯微鏡下可見(jian)絲狀(zhuang)、管狀(zhuang)或樹枝狀(zhuang)的菌(jun)絲縱橫交錯在細胞之間(jian)或培養(yang)(yang)基中，有(you)的呈鏈狀(zhuang)排(pai)列。

　　真菌污染(ran)后，細胞(bao)生長變(bian)慢，但最后由于營養(yang)耗(hao)盡及毒性作用(yong)而(er)使細胞(bao)脫(tuo)落死(si)亡。

　　

絲狀菌污染

　　3、支原體污染

　　支原體是介(jie)于細菌與病毒之(zhi)間(jian)能獨立生活的最(zui)小(xiao)微生物，最(zui)小(xiao)直(zhi)徑0.2μm，一般(ban)過濾除菌無(wu)法去除它(ta)，光(guang)鏡下難(nan)以看清它(ta)的形態結(jie)構。開始(shi)不易發現，能在(zai)(zai)偏(pian)堿(jian)條件(jian)下生存，對青霉(mei)素有抗藥性。多(duo)吸附于細胞表(biao)面(mian)或散在(zai)(zai)于細胞之(zhi)間(jian)。

　　培養細(xi)胞(bao)(bao)受(shou)支原體污(wu)染(ran)后(hou)，部(bu)分(fen)敏感細(xi)胞(bao)(bao)可(ke)見細(xi)胞(bao)(bao)生(sheng)長增(zeng)殖變(bian)慢，部(bu)分(fen)細(xi)胞(bao)(bao)變(bian)圓，從瓶壁脫落(luo)。但多數細(xi)胞(bao)(bao)污(wu)染(ran)后(hou)無明顯變(bian)化(hua)，或(huo)略(lve)有變(bian)化(hua)，若不及時處理，還(huan)會產生(sheng)交叉污(wu)染(ran)。

    

陽性                    陰性

　　4、病毒污染(ran)

　　組(zu)織細胞(bao)培養(yang)過程中，如果沒有(you)除(chu)去(qu)潛在(zai)的病毒，就會產生(sheng)病毒污染。目(mu)前(qian)，從原(yuan)代猴(hou)腎細胞(bao)的培養(yang)中已發現不少(shao)于(yu)20種(zhong)血清(qing)性病毒。

　　盡管病(bing)毒污染的(de)細胞(bao)不影響(xiang)原代培養，但(dan)生(sheng)產疫苗是不安全的(de)。因(yin)此，潛(qian)在(zai)病(bing)毒是細胞(bao)大量生(sheng)產和疫苗、干擾素等生(sheng)物制(zhi)品制(zhi)作中(zhong)的(de)難題。

　　5、非同(tong)種(zhong)細(xi)胞污染

　　由(you)于(yu)細胞(bao)(bao)培養操作時各(ge)細胞(bao)(bao)株所(suo)需的器材(cai)和溶液沒有嚴(yan)格分開(kai)，往往會(hui)使(shi)一種細胞(bao)(bao)被另一種細胞(bao)(bao)污(wu)染(ran)。目前，世界上(shang)已(yi)有幾十種細胞(bao)(bao)都(dou)被HeLa細胞(bao)(bao)所(suo)污(wu)染(ran)，致使(shi)許多實驗宣告(gao)無效。

　　非細(xi)胞培(pei)養物(wu)(wu)(wu)所(suo)(suo)造成(cheng)的(de)化學成(cheng)分(fen)的(de)污染(ran)也偶有(you)發生，大多是(shi)由(you)于(yu)細(xi)胞培(pei)養所(suo)(suo)需物(wu)(wu)(wu)品清洗消毒不徹底而帶入一些有(you)毒化學物(wu)(wu)(wu)質所(suo)(suo)致。

　　(二)污染的鑒別

　　1、細(xi)菌、真(zhen)菌污染的檢(jian)測

　　(1)肉眼觀察

　　細菌(jun)、真菌(jun)污染常在傳代、換液(ye)、加樣等開放性操作之后發生，而且增生迅(xun)速(su)，若有(you)污染，在48小時內可明顯觀(guan)察到(dao)，例如培(pei)養(yang)液(ye)變混濁，或(huo)略加振蕩(dang)有(you)很多漂浮物漂起。

　　(2)接種(zhong)觀察

　　采用(yong)普(pu)通肉(rou)湯接(jie)種或用(yong)未加雙抗藥物(wu)的培養液接(jie)種，也可發(fa)現是否有污染。

　　(3)鏡(jing)下觀察

　　在倒置顯微(wei)鏡(jing)的高倍鏡(jing)下可見(jian)培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即(ji)為細(xi)菌污染。

　　若細胞(bao)之間(jian)有絲狀、管狀、樹枝狀或(huo)卵形(xing)的物(wu)質常為(wei)真菌污(wu)染。

　　2、支原(yuan)體污染(ran)的檢測

　　(1)相差顯微鏡(jing)觀察

　　直接取少許培養(yang)液滴在(zai)載(zai)物片上，再(zai)蓋上蓋片觀察(cha)，支(zhi)原(yuan)體在(zai)鏡下(xia)呈暗色微小顆粒，多位(wei)于(yu)細(xi)胞與細(xi)胞之間(jian)，有(you)時(shi)可見類似于(yu)布朗(lang)運動的(de)表現。應注意與細(xi)胞破(po)碎溢出的(de)內容物如線粒體等相區別。

　　(2)熒光染(ran)色法(fa)觀(guan)察

　　用熒(ying)(ying)光染(ran)料(liao)Hoechst33258，此染(ran)料(liao)能與DNA特(te)異(yi)地結合，可使支原(yuan)體(ti)內的DNA著色(se)，熒(ying)(ying)光顯微鏡下支原(yuan)體(ti)呈綠(lv)色(se)小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。

　　(3)電鏡檢測(ce)

　　若條件許可，可用掃描(miao)電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞(bao)培養(yang)48～72小時，細胞(bao)接近匯合前，用胰(yi)酶(mei)消化(hua)細胞(bao)制成細胞(bao)懸液后(hou)進行固定、包埋(mai)、切片后(hou)才(cai)能進行觀察。

　　

支原體(ti)掃描電鏡圖片(pian)

　　(4)培養檢測

　　將細(xi)胞(bao)懸(xuan)液5mL加(jia)入(ru)45mL支原體肉湯(tang)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)，培(pei)(pei)養(yang)(yang)14天后觀察(cha)(cha)肉湯(tang)培(pei)(pei)養(yang)(yang)有無(wu)霧狀沉淀(dian)，然后取(qu)0.5ml加(jia)入(ru)已冷卻到50℃的培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)中，再(zai)用瓊脂(zhi)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)做分離培(pei)(pei)養(yang)(yang)，37℃培(pei)(pei)養(yang)(yang)3天觀察(cha)(cha)有無(wu)“荷包蛋(dan)”菌(jun)落出現。

　　3 、病(bing)毒的檢測

　　1) 應(ying)用電鏡技術(shu)快速診斷(duan)動物病毒病

　　

冠狀(zhuang)病毒電鏡圖

　　2) 逆轉錄_聚合酶鏈反(fan)應(ying)RT_PCR檢測病毒

　　(三)污染的清除

　　培(pei)養細(xi)(xi)胞一經(jing)污染，多數較難處理。如果污染細(xi)(xi)胞價值不大，宜(yi)棄之(zhi);在尋找原因后徹底消(xiao)毒操作(zuo)室，復蘇或重(zhong)新購置細(xi)(xi)胞，再培(pei)養。

　　若污染細胞價值較大(da)，又難于重(zhong)新得到，可采取以下辦法清除。

　　一、細(xi)菌(jun)和真菌(jun)的(de)清除(chu)

　　1、使(shi)用抗生素

　　抗生(sheng)素對殺滅細菌較有效(xiao)。聯合用(yong)(yong)藥(yao)(yao)比單獨用(yong)(yong)藥(yao)(yao)效(xiao)果好(hao)。預防用(yong)(yong)藥(yao)(yao)比污染(ran)后(hou)(hou)再用(yong)(yong)藥(yao)(yao)效(xiao)果好(hao)。預防用(yong)(yong)藥(yao)(yao)一(yi)般用(yong)(yong)雙抗生(sheng)素，污染(ran)后(hou)(hou)清除用(yong)(yong)藥(yao)(yao)需(xu)采用(yong)(yong)大于常(chang)用(yong)(yong)量5～10倍的沖洗法，于加藥(yao)(yao)后(hou)(hou)作用(yong)(yong)24～48小時(shi)，再換常(chang)規(gui)培養液。此法在污染(ran)早期有效(xiao)。

　　二、支原體的清除(chu)

　　1、用MRA處理

　　用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細(xi)胞，每(mei)4天(tian)(tian)換(huan)一次(ci)液,連續(xu)處理15天(tian)(tian)以確(que)保細(xi)胞純潔健康，效(xiao)果(guo)好.

　　2、用清洗純化法(fa)清除支原(yuan)體污染(ran)的方法(fa)

　　細胞營養馴化(hua)→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌

　　其原(yuan)理是利用(yong)離(li)心(xin)力(li)、細(xi)胞、微生物(wu)質(zhi)量和懸液的(de)(de)浮力(li)差(cha)達到清(qing)除支原(yuan)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)目的(de)(de)。由于支原(yuan)體(ti)(ti)(ti)個(ge)體(ti)(ti)(ti)小且除發酵支原(yuan)體(ti)(ti)(ti)外(wai)多為細(xi)胞外(wai)寄生,所(suo)以(yi)通過(guo)反(fan)復洗滌細(xi)胞和低速離(li)心(xin)換液使其中潛(qian)在(zai)的(de)(de)支原(yuan)體(ti)(ti)(ti)數量降低至極限。

　　如(ru)結合(he)敏感抗生(sheng)素的(de)(de)抑(yi)殺作用，可達到更好的(de)(de)效果。

　　3、藥物輔助加(jia)溫(wen)處理

　　先用藥物處理后(hou)，再將污染的組織(zhi)培養(yang)(yang)物放在41℃培養(yang)(yang)18小時，可殺死支(zhi)原(yuan)體(ti)，但對細胞有不良影響。

　　4、使用支原體特(te)異性血清

　　用(yong)5%的兔支(zhi)原體免疫血清可去除支(zhi)原體污(wu)染(ran)，因特異抗體可抑制支(zhi)原體生長，故經抗血清處理后11天即轉為陰性，并(bing)且5個月后仍為陰性。但此法(fa)比較麻(ma)煩，不如(ru)用(yong)抗生素方便、經濟。

　　(四)、污染的預防

　　預防(fang)是防(fang)止細胞培養過程中發生污染的最(zui)好辦法。只(zhi)有預防(fang)工作(zuo)做在前，才(cai)能將發生污染的可能性降到最(zui)小程度。

　　一(yi)般預防可從以(yi)下幾方(fang)面著手：

　　1、添加抗(kang)生(sheng)素

　　2、從物品、用品消毒滅菌著手

　　細(xi)胞培(pei)養所用物品(pin)清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌(jun)除(chu)菌(jun)要仔細(xi)，并在無菌(jun)試(shi)驗(yan)陰性后才能使(shi)用。

 　　操作(zuo)室及剩(sheng)余的無菌(jun)器材要定(ding)期(qi)清潔消毒滅菌(jun)。

　　3、從操作(zuo)者做起

　　(1)進(jin)無菌室前要用肥(fei)皂(zao)洗手(shou)，按規定穿隔離衣(yi)。工作開(kai)始(shi)要先用75%酒(jiu)精棉球擦手(shou)、擦瓶口(kou)和(he)燒灼瓶口(kou)。

　　(2)操作(zuo)(zuo)者動(dong)作(zuo)(zuo)要輕(qing)，必須在火焰周圍無菌區內打開(kai)瓶口(kou)，并(bing)將瓶口(kou)轉(zhuan)(zhuan)動(dong)燒灼(zhuo)。操作(zuo)(zuo)時盡量不(bu)要談話，若(ruo)打噴嚏(ti)或(huo)咳(ke)嗽應轉(zhuan)(zhuan)向背(bei)面(mian)。

　　(3)操(cao)作(zuo)時要常(chang)更(geng)換吸管，一(yi)旦發現吸管口接(jie)觸了手和(he)其他污染物品應棄去。實驗(yan)完畢用消毒水浸泡的紗布(bu)擦臺(tai)面。

　　4、防止(zhi)細胞交叉污染

　　在進(jin)行多種細胞培養操作時(shi)，所用器具要嚴格區分。

　　在(zai)進(jin)行(xing)換(huan)液或傳代(dai)操作時(shi)，注(zhu)射器和滴管不要觸及(ji)細胞培(pei)養瓶瓶口，以免把細胞帶到培(pei)養液中(zhong)污(wu)染其(qi)他細胞。

　　細胞一旦(dan)購置或從別處引入，均應及(ji)早留(liu)種凍存，一旦(dan)發生污染可重新復(fu)蘇培養。

　　5、無菌室的徹(che)底消毒(du)

　　1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室;

　　2)甲(jia)(jia)醛(quan)(quan)熏蒸法：甲(jia)(jia)醛(quan)(quan)是一種(zhong)廣譜滅(mie)菌劑菌，其(qi)水溶液和氣休(xiu)對(dui)各種(zhong)細菌、芽(ya)孢及真菌等微生物均有殺滅(mie)作用。